научная статья по теме ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ПОЛОЖЕНИЕ ГУБОК ОЗЕР ЧАГЫТАЙ И ТОРЕ-ХОЛЬ Биология

Текст научной статьи на тему «ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ПОЛОЖЕНИЕ ГУБОК ОЗЕР ЧАГЫТАЙ И ТОРЕ-ХОЛЬ»

ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ

УДК 575.86

ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ПОЛОЖЕНИЕ ГУБОК ОЗЕР ЧАГЫТАЙ И ТОРЕ-ХОЛЬ

© 2010 г. О. О. Майкова, В. Б. Ицкович, Н. А. Семитуркина, О. В. Калюжная, С. И. Беликов

Учреждение Сибирского отделения Российской академии наук Лимнологический институт, Иркутск 664033;

e-mail: idboo8@mail.ru Поступила в редакцию 10.12.2009 г.

Проведены морфологические и молекулярно-генетические исследования пресноводных губок из озер Тувинской котловины: Baikalospongia dzhegatajensis (Rezvoj, 1936) формы Dzh05 и Dzh06 из озера Чагытай и формы TKhl и TKh2 из озера Торе-Холь. Определены нуклеотидные последовательности ITS-районов рРНК исследуемых губок, которые на филогенетическом древе кластеризуются вместе с губкой Ephydatia fluviatilis (Linneaus, 1758) семейства Spongillidae. Сравнивали также нук-леотидные последовательности высоковариабельного межгенного участка митохондриального генома трех губок семейства Spongillidae (E. fluviatilis, E. muelleri, Spongilla lacustris), а также губок из озер Чагытай и Торе-Холь (Dzh06 и TKh2) с неизвестным статусом и пяти губок байкальского семейства Lubomirskiidae. Минимальные генетические отличия наблюдаются между E. fluviatilis, Dzh06 и TKh2 (от 0.003 до 0.01% нуклеотидных замен), максимальные — между видами семейств Lubomirskiidae и Spongillidae (от 0.928 до 2.06%). Результаты свидетельствуют о том, что губки из озер Чагытай и Торе-Холь наиболее близки виду E. fluviatilis.

Губки (тип РогИега) — это древнейшие многоклеточные беспозвоночные животные, существующие более чем 580 млн. лет [1]. Из 15000 описанных видов лишь около 150 принадлежат к семи семействам отряда Иар1о8е1ейёа (Тор8еп1, 1928) (класс Эешо8роп§1ае) и живут в пресной воде [2].

В настоящее время для исследования биоразнообразия, таксономии и эволюции губок используются не только морфологические, но и мо-лекулярно-генетические методы. Несмотря на это, как отмечено в обзоре Эрпенбека и Ворхайде [3], единого мнения о систематике губок нет. В частности, остается открытым вопрос о происхождении ряда семейств пресноводных губок и о филогенетических взаимоотношениях близкородственных видов эндемичной байкальской спонгиофауны [4, 5].

В озере Байкал обитают губки, принадлежащие к двум семействам: эндемичному ЬиЬошткь 1ёае и космополитному 8роп§ПИёае, представленному в Байкале четырьмя родами (Ephydatia, Еи-паршз, БрощШа, Trochospongilla) и пятью видами, обитающими на мелководье и в соровых озерах [4, 5]. Подавляющее большинство байкальских губок принадлежит семейству ЬиЬотткпёае; Ефремова [4, 5] описывает в его составе четыре рода — ЬиЬоштШа, Baikalospongia, Swartsсhewskia, Rezinkovia, выделяет 13 видов и один подвид. Несмотря на то, что данное семейство считается эндемичным, П.Д. Резвым к нему был отнесен один внебайкальский вид Baikalospongia dzhegatajensis (Яегтоь 1936) и его разновидность В. dzhegatajensis уаг. Lissosclera (Яе^о^ 1936), местом обитания ко-

торых является озеро Чагытай, расположенное в Тувинской котловине [6]. Однако, по мнению Ефремовой [4], систематическое положение B. dzhegatajensis нуждается в пересмотре, и данный вид следует относить к семейству Spongillidae. В принадлежности B. dzhegatajensis к семейству Lubomirskiidae заставляет сомневаться и то, что озера Чагытай и Байкал значительно географически удаленны друг от друга (рис. 1,а). Молекулярные данные на основе анализа последовательностей митохондриального гена COI показали, что B. dzhegatajensis принадлежит к кластеру, в который входят такие виды, как Ephydatia fluviatilis, E. cooperensis, Ochridaspongia sp., а также байкальская губка Swartschewskia papyracea [7]. При этом подразделение семейств Lubomirskiidae и Spongillidae остается неразрешенным. Таким образом необходимы дополнительные исследования для определения филогенетического положения губок озера Чагытай Тувинской котловины с помощью моле-кулярно-генетических маркеров.

Ранее показана информативность внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS) рибосомной РНК как молекулярно-генетического маркера для реконструкции филогенетических отношений у пресноводных губок [8]. Такие признаки, как небольшой размер, быстрая эволюция и наличие высококонсервативных фланкирующих последовательностей, позволяющих сконструировать праймеры, облегчают использование ITS-районов для филогенетических реконструкций. Последовательности ITS-районов используются для анализа внутриродовых, межвидовых и попу-

1670

Рис. 1. Карта-схема расположения озер: 1 — озеро Чагытай; 2 — озеро Торе-Холь; 3 — озеро Байкал. а — расположение озер Чагытай и Торе-Холь относительно озера Байкал; б — расположение озер Чагытай и Торе-Холь относительно друг друга (озера выделены рамкой).

ляционных филогенетических отношений, а также для видовой идентификации [9—11].

В последнее время проведен ряд исследований, направленных на анализ мтДНК губок; в частности, определены нуклеотидные последовательности 23 полных митохондриальных геномов Demospongiae [12—16, 21]. Показано, что большинство видов Demospongiae, в том числе и отряд Haplosclerida, к которому относятся семейства Lubomirskiidae и Spongillidae, имеют низкую скорость эволюции нуклеотидной последовательности генов мтДНК [17]. Это значит, что использование индивидуальных митохондриальных генов для филогенетических реконструкций и идентификации близкородственных видов губок, какими являются виды семейства Lubomirskiidae, малоинформативно, что и было показано Ицкович с соавт. [18] на примере гена COI. Однако в мито-хондриальных геномах губок имеются высоковариабельные нетранслируемые последовательности, сосредоточенные между генами. Их протяженность, по данным Ванга и Лаврова [12], составляет от 2 до 24% от общего размера генома. Именно из этих последовательностей нами выбран участок с тем, чтобы исследовать его пригодность для определения систематического положе-

ния губок. В качестве молекулярно-генетического маркера мы использовали нетранслируемый участок между генами митохондриального генома тРНКТуг и тРНКМй.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В 2005 и 2006 гг. в экспедиции на озеро Чагытай (рис. 1,5) были собраны различающиеся по внешнему виду губки, которые мы обозначили как формы Dzh05 и Dzh06 (рис. 2,а, б). Для сравнения: не описанные ранее губки в озере Торе-Холь (республика Тува) (рис. 1,б) также различаются по внешнему виду (формы TKhl и TKh2 (рис. 3,а, б)). Образцы губок собирали на глубинах от 1 до 5 м. Собрано около 50 экземпляров каждой формы из разных районов озер. Образцы губок фиксировали в 96%-ном этаноле или высушивали.

Морфологический анализ спикул проводили с помощью светового микроскопа "Oxiovert" и сканирующего электронного микроскопа SEM 525-M "Philips", анализ скелета губок — с помощью сте-реомикроскопа МБС-10. Образцы спикул для изучения под электронным микроскопом получали путем растворения ткани губок в растворе гипо-

б

Рис. 1. Окончание.

хлорита Na. Для световой микроскопии фиксированные препараты спикул и скелета подготавливали по методике, описанной Ефремовой [19].

Суммарную ДНК выделяли, либо используя метод осаждения на сорбенте (набор "РИБО-сорб-50"), либо путем лизиса в SDS-буфере в присутствии протеиназы К [20].

Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе фирмы DNA Engin DYAD™ "MJ Research". Параметры амплификации: первичная денатурация 94°C — 5 мин, затем 30—35 циклов в режиме: 95°С - 30 с, 58°С - 30 с, 72°С - 45 с с последующей выдержкой при 72°С в течение 10 мин. Для амплификации ITS-районов использовали прайме-ры: прямой (fw13) 5'-TACACACCGCCCGTCGC-TACTA-3' и обратный (rv1278) 5'-TYYGACGTGC-CTTTCCAGGT-3'. Для межгенного вариабельного

фрагмента митохондриального генома сконструированы праймеры на консервативные участки последовательностей генов транспортных РНК: тРНКМй и тРНКТуг, которые имели следующую структуру: прямой (trnY-trnM_L) 5'-GATGGCA-GAGCGGTAATGC-3' и обратный (trnM-trnY_R) 5'-GTAGGTTCGAGTCCTGCCT-3'. Для конструирования праймеров мы использовали нуклео-тидные последовательности полных митохондри-альных геномов L. baicalensis [21] и E. muelleri (NC_010202.1) [12].

Полученные ампликоны анализировали с помощью метода электрофореза в 0.8%-ном агароз-ном геле. Продукт выделяли из геля на колонках QIAquick Spin column "QIAGEN". Очищенные фрагменты амплифицированной ДНК клонировали в векторе pTZ57R/T "Fermentas" по методи-

Рис. 2. Внешний вид губок из озера Чагытай B. dzhe-

gatajensis формы Dzh05 (а) и формы Dzh06 (б).

ке фирмы-производителя. Нуклеотидные последовательности определяли с помощью секвенато-ра CEQ™ 8800 "Beckman Coulter".

Структуры сравнивали, используя программу BLAST [22]. Множественное выравнивание нук-леотидных последовательностей осуществляли с помощью программы MAFFT v. 6.240 [23] и Bio-Edit. Филогенетический анализ проводили методами наибольшего правдоподобия (ML), максимальной экономии (MP) и объединения ближайших соседей (NJ) (пакеты программ MEGA4 [24] и TREE-PUZZLE [25]). С помощью программы Modeltest 3.04 [26] в качестве оптимальной модели нуклеотидных замен была определена TVM + I + + G-модель. Генетические дистанции между после-

s^ifL

Рис. 3. Внешний вид губок из озера Торе-Холь: а — Tore-Khol 1; б — Tore-Khol 2.

довательностями получены с помощью двупара-метрической модели Кимуры. Вторичные структуры 1Т8-района рРНК получали с помощью сервера ШоЫ (версия 3.2) [27].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Краткий морфологический анализ губок озер Чагытай и Торе-Холь

Формы B. dzhegatajensis 02М5 и 02М6 имеют между собой значительные морфологические отличия по форме тела, а также спикул и скелета. Структуры скелета различаются в основном по количеству спикул в главных и поперечных пучках. Спикулы у всех экземпляров представлены амфиоксами, которые сильно варьируют по количеству шипов, а также по длине и ширине спикул. Губки из озера Торе-Холь, названные нами как ТЕМ и ТКЬ2, также значительно различаются между собой по форме тела и структуре скелета, но имеют сходную морфологию спикул. У всех

40 34

31

31

20

53

100/100/100

*/89/66

6

56/76/56

741 Baikalospongia bacillifera

-Baikalospongia martinsoni

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком