МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 1, с. 68-77
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.81.083.18
ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ПОЛОЖЕНИЕ ПУРПУРНОЙ СЕРОБАКТЕРИИ LAMPROBACTER MODESTOHALOPHILUS НА ОСНОВАНИИ
ИССЛЕДОВАНИЯ НОВЫХ ШТАММОВ ВИДА © 2015 г. В. М. Горленко*, И. А. Брянцева*, О. Н. Лунина*, Т. П. Турова*
*Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 18.02.2014 г.
В 1979 г. был описан род галофильных пурпурных серобактерий (ПСБ) Lamprobacter с единственным видом Lpb. modestohalophilus. Для палочковидных бактерий рода Lamprobacter характерно присутствие в клетках газовых вакуолей в неподвижной стадии роста культуры, а также изредка возникающие подвижные клетки, лишенные газовых везикул. Бактерии содержали бактериохлорофилл а и каротиноид окенон. Названия этого рода и вида в 1988 г. включены в список одобренных названий микроорганизмов. Типовой штамм Lpb. modestohalophilus RO1T был утрачен, и, как следствие, данных анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК этого вида не было получено. В 1998 г. на основании анализа гена 16S рРНК, был создан новый род Halochromatium, объединивший подвижные экстремально галофильные виды Chromatium-подобных бактерий. Представители этого рода не содержат в клетках газовые вакуоли. Несмотря на фенотипические отличия родов ПСБ Lamprobacter и Halochromatium филогенетические границы для этих таксонов не были определены. Таксономическая ситуация осложнилась после того как морская бактерия, по морфофизиологиче-ским признакам принадлежащая к роду Lamprobacter, была описана как новый вид рода Halochroma-tium с видовым названием Hch. roseum. В нашей работе приводятся аргументы в пользу сохранения двух фенотипически и филогенетически различных родов Lamprobacter и Halochromatium. Предлагается считать Lpb. modestohalophilus типовым видом рода Lamprobacter. На современном уровне исследованы свойства двух штаммов Lamprobacter modestohalophilus, один из которых (штамм Sivash) предложен в качестве неотипового штамма данного вида. Предлагается также сохранить род Halochromatium, оставив в нем экстремально-галофильные виды Hch. salexigens и Hch. glycolicum, в то время как слабо галофильный Halochromatium roseum предложено перенести в род Lamprobacter, создав новую комбинацию Lamprobacter roseus comb. nov.
Ключевые слова: галофильные пурпурные серобактерии, филогения, таксономия, Lamprobacter modestohalophilus, Halochromatium roseum, Lamprobacter roseus comb. nov.
DOI: 10.7868/S002636561406007X
В 1979 г. был описан новый род и вид пурпурных серобактерий Lamprobacter modestohalophilus. Штаммы этого вида RO-1T и WS-1, были выделены из соленых озер Розовый Порсугель (п-ов Че-ликен, Туркмения) и Вейсово (г. Славянск, Украина) [1]. Клетки новой бактерии имели палочковидную или овальную форму и сложный жизненный цикл с чередованием двух морфологических форм: подвижные с помощью жгутиков клетки, лишенные газовых везикул в активной фазе роста, и неподвижные клетки с газовыми везикулами в зрелой культуре. Фотосинтетическими пигментами были бактериохлорофилл (Бхл) а и каротиноид окенон. Для своего роста бактерии требовали присутствия хлористого натрия с оптимумом солености 1—2%. Lp. modestohalophilus был описан
1 Автор для корреспонденции (e-mail: vgorlenko@mail.ru).
только на основании морфофизиологических свойств [1—3] и включен в список одобренных названий [4, 5]. Типовой штамм вида ЯО-1Т был утрачен, поэтому в качестве неотипа был предложен новый штамм ЬрЬ. modestohalophilus ВЬ^И [6]. Этот штамм был объектом исследования пигмент-белковых комплексов фотосинтезирующе-го аппарата данного вида, свойств гидрогеназы и генов, кодирующих РуБисКО [7—9]. Длительное время последовательность аминокислот гена 168 рРНК штамма ВЬ^И не исследовалась, поэтому формально штамм не мог служить в качестве неотипового. В 2002 г. из меромиктического соленого сибирского озера Шунет был выделен еще один штамм 8ИМЬЬ02 пурпурных серобактерий, фенотипически близкий ЬрЬ. modestohalophilus [10].
В настоящей работе приводятся результаты филогенетического и морфофизиологического
исследования двух штаммов Lpb. modestohalophilus Sivash и ShNLb02, один из которых (Sivash) предложен в качестве неотипового данного вида и рода.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Источник выделения новых штаммов. Lpb. modestohalophilus Sivash был выделен в 1987 г. из ци-анобактериального мата мелководного соленого озера Сиваш (Крым) с рН 7.8 и минерализацией 40 г/л. Lpb. modestohalophilus ShNLb02 был выделен в 2002 г. из воды редокс-зоны соленого евтрофно-го меромиктического озера Шунет (Хакасия, Россия) с глубины 4.5 м. Этот водоем характеризуется сульфатно-хлоридно-натриево-магние-вым типом воды с резко выраженным градиентом солености (10—65 г/л) и значительным содержанием сероводорода (более 500 мг/л) у дна.
Выделение и очистка. Для культивирования Lpb. modestohalophilus использовали среду следующего состава (г/л дистиллированной воды): KH2PO4 - 0.5; NaCl - 20-40; MgCl2 - 0.2; NH4Cl -0.5; KCl - 0.33; NaHCO3 - 1,5; CaCl2 • 6H2O - 0.1; Na2S • 9H2O - 0.5; Na2S2O3 • 5H2O - 0.5, Na-ацетат • • 3H2O - 0.5; дрожжевой экстракт - 0.1; витамин В12 - 20 мкг; раствор микроэлементов - 1 мл [11]; pH среды составлял 7.5.
Для культивирования штамма ShNLb02 применяли ту же среду, но использовали смесь солей, приближенную к химическому составу воды озера Шунет (г/л дистиллированной воды): NaCl -5.3; MgSO4 • 7H2O - 0.5; NH4Cl - 0.7; KCl - 0.33; Na2SO4 - 21; MgCl2 • 7H2O - 4.3.
Чистые культуры получали посевом отдельно выросших колоний на агаризованую питательную среду (0.7%) методом серийных разведений. Бактерии выращивали анаэробно в 30 мл флаконах с завинчивающими крышками, на свету при освещении 2000 люкс, при температуре 30°С.
Спектры поглощения пигментов живых клеток в 50% глицерине и ацетон-метаноловых (7 : 2) экстрактов измеряли на спектрофотометре СФ-56 ("ЛОМО", Санкт-Петербург, Россия).
Морфологию бактерий изучали в световом и электронном микроскопах. Тотальные препараты для электронной микроскопии окрашивали 2% уранилацетатом. Ультратонкие срезы получали по стандартной методике, как описано ранее [12].
Для определения использования различных органических субстратов, отношения к разным значения рН и концентрациям солей применяли базовую минеральную среду с сульфидом (0.5 г/л), тиосульфатом (0.5 г/л) и дрожжевым экстрактом (0.05 г/л). Органические субстраты добавляли в концентрации 0.5 г/л базовой среды. В стационарной фазе рост фиксировали по оптической плотности культуры при 650 нм с помощью фото-
метра КФК-3 (Россия). Тиосульфат, сульфид и сульфид определяли иодометрическим титрованием [13], сульфат — турбидометрически [14]. Способность использовать органические субстраты определялась по разнице между фотоавтотрофным ростом и ростом в присутствии органического субстрата.
ДНК выделяли методом Мармура [15]. Состав оснований в ДНК определяли методом термической денатурации [16]. ДНК—ДНК гибридизацию проводили методом оптической реассоциации [17].
Выделение ДНК, амплификация и секвенирова-ние генов 16S рРНК. Выделение и очистку препаратов ДНК для анализа нуклеотидов гена 16S рРНК проводили согласно методике, описанной ранее [18]. Для проведения амплификации генов 16S рРНК использовали универсальные для бактерий праймеры [19]. Секвенирование продуктов амплификации проводили по Сэнгеру с помощью набора Big Dye Terminator v. 3.1 на автоматическом секвенаторе ABI 3730 ("Applied Biosystems, Inc.", США) согласно инструкциям производителя.
Филогенетический анализ последовательностей гена 16S рРНК. Редактирование последовательностей проводили с помощью редактора BioEdit [http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html]. Первичный сравнительный анализ полученных de novo последовательностей с последовательностями из базы данных GenBank проводили с помощью программы NCBI BLAST [http://www.ncbi.nlm. nih.gov/blast]. Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК штаммов были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий с помощью программы CLUSTALW v. 1.75. Построение филогенетического дерева исследуемых штаммов производили с помощью методов, реализованных в пакете программ TREE-CONW [http://bioc-www.uia.ac.be/u/yvdp/treeconw. html] и PHYLIP [http://evolution.genetics.washington. edu/phylip.html].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Выделенные бактерии имели сходную морфологию, их клетки овальные или палочковидные, размером 2.0—2.5 мкм х 4—5 мкм. При росте на среде с субоптимальной повышенной соленостью клетки были слабо извиты. Размножались бактерии бинарным делением. Оба штамма имели выраженный цикл развития. В молодых культурах наблюдали немногочисленные подвижные клетки с нерегулярно расположенными жгутиками (рис. 1б). В зрелых культурах преобладали неподвижные клетки с газовыми везикулами (рис. 1а). Включения элементной серы (рис. 1а) в клетках появлялись на ранней стадии роста и в процессе роста исчезали.
Рис. 1. Морфология (а, б) и тонкое строение (в) ЬрЬ. modestohalophilus 81уа8И (а, б) и 8ИМЬЬ02 (в). Масштаб: (а), (в) — 0.5 мкм; (б) — 1 мкм. Условные обозначения: КС — клеточная стенка, В — везикулярные фотосинтетические структуры, ГВ — газовые везикулы, 8 — внутриклеточная сера.
Клеточные суспензии исследованных штаммов были пурпурно-розового цвета. Абсорбционные спектры живых клеток обоих штаммов в основном совпадали друг с другом и со спектром ранее описанного штамма ЬрЬ. modestohalophilus ЯО-1Т. Пики при 395, 830 и 880 нм свидетельствовали о наличии в клетках Бхл а, тогда как максимум поглощения при 512 нм и плечи при 485 и 540 нм указывали на присутствие каротиноида окенон (рис. 2). Абсорбционные спектры экстрактов пигментов подтверждали присутствие в клетках Бхл а (360 и 770 нм) и каротиноида окено-на (489 и 579 нм).
На ультратонких срезах клеток исследованных штаммов выявлялся хорошо развитый фотосинте-зирующий аппарат везикулярного типа (рис. 1в). Строение клеточной стенки соответствовало гра-мотрицательному типу с выраженной двуслойной внешней мембраной и заметным периплазматиче-ским про
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.