МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 76, № 1, с. 129-131
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 579.25+579.262
ФИЛОГЕНИЯ И ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ, ВСТУПАЮЩИХ В СИМБИОЗ С АСТРАГАЛОМ НУТОВЫМ
© 2007 г. Ал. X. Баймиев1, Ан. X. Баймиев, И. И. Губайдуллин, О. Л. Куликова, А. В. Чемерис
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, Уфа Поступила в редакцию 19.01.2006 г.
Род Astragalus объединяет одну из самых многочисленных групп бобовых растений и насчитывает до 2000 видов. Описано около 90 видов астрагалов, вступающих в симбиоз с клубеньковыми бактериями [1], однако таксономия и популяци-онное разнообразие последних до сих пор недостаточно изучены. Чен и соавт. описали ризобии, изолированные из клубеньков Astragalus sinicus растущего в Китае, как Mesorhizobium huakuii [2]. Изучение ризобий из клубеньков Astragalus adsur-gens из разных географических регионов Китая показало, что они очень гетерогенны и относятся к Agrobacterium, Rhizobium, Mesorhizobium и Sinorhizo-bium [3]. Ризобии, схожие с Rhizobium galegae и R. huautlense из клубеньков Astragalus complanatus, A. chrysopterus и A. scobwerrimus, предложено объединить в вид R. loessense [4]. Определитель растений Башкирской АССР описывает 20 видов астрагалов. Астрагал нутовый является типичным представителем рода и широко распространен в Башкортостане.
Мы анализировали бактерии из клубеньков астрагала нутового, произрастающего на горе Чесноковская Уфимского района Республики Башкортостан. Для работы отбирали клубеньки различной морфологии - от мелких округлых 12 мм в диаметре на молодых, первого года растениях до вильчатых и гроздевидных, на старых растениях. Поверхность клубеньков стерилизовали последовательно 10 мин в 70% этаноле и 10 мин в 10% гипохлорите натрия, затем многократно промывали стерильной водопроводной водой. Клубенек разрушали до гомогенного состояния пинцетом в микропробирке в 20 мкл среды TY (0.1% дрожжевого экстракта, 1% бакто-трип-тона, 0.1% CaCl2) с соблюдением условий стерильности. Суспензию центрифугировали на вор-тексе и супернатант рассевали на чашки Петри со средой TY. Колонии ризобий диаметром 1-2 мм формировались при инкубации 28°С на 2-3 сутки. Отдельные выросшие колонии пересевали на новые чашки Петри со средой TY и дальше часть
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: alex@anrb.ru).
выросшей бактериальной массы брали для анализа, а часть суспендировали в среде TY с 20% глицерина и криоконсервировали при -70°С. Вирулентность проверяли, заражая недельные стерильные проростки астрагала нутового. Все штаммы образовывали морфологически нормальные клубеньки через месяц после инокуляции. Тест на перекрестную инокуляцию показал, что ризобии не способны образовывать клубеньки на люцерне, козлятнике восточном, эспарцете песчаном и клевере луговом. Генетическое разнообразие собранных штаммов исследовали с помощью RAPD-ана-лиза. Бактериальную ДНК выделяли стандартным методом, используя перхлорат натрия и смесь фенола и хлороформа после обработки клеток ли-зоцимом и ЭДтА, а также гуанидиновым методом с использованием сорбентов. ПЦР проводили на амплификаторах МС2 "Терцик" компании "ДНК-технология" (Россия) и "T1 Thermocycler" фирмы "Biometra" (Германия) с использованием стандартных наборов для амплификации ДНК.
С применением нескольких "произвольных" праймеров анализировали полиморфизм ДНК ризобий из более чем 100 клубеньков. Было обнаружено, что для исследуемых образцов характерно наличие большого количества (до 60% от общего числа для отдельных праймеров) совпадающих полос в их RAPD-профилях, что указывает на филогенетическое родство клубеньковых бактерий астрагала нутового. Тем не менее, анализируемые штаммы можно условно разбить на три группы по схожести распределения полос амплифицирован-ной ДНК с соотношениями представленности в выборке 80 : 15 : 5. В качестве примера на рис. 1 представлены RAPD-профили ДНК бактерий из клубеньков с одного растения с применением праймера 5'-CAGGCCCTTC-3', где к группе 2 относятся образцы 5 и 18, к группе 3 - 17, все остальные - к группе 1.
Филогению исследуемых штаммов изучали се-квенированием генов 16S рРНК. Определение нуклеотидных последовательностей проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 фир-
130
БАЙМИЕВ и др.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Рис. 1. Электрофореграмма RAPD-aнaлизa амплифицированной ДНК штаммов бактерий (1-20) из клубеньков астрагала нутового с использованием произвольного олигонуклеотидного праймера 5'-САООСССТТС-3'
мы "Applied Biosystems, Inc." (США) с помощью наборов "Big Dye Terminator v.3.0". Поиск сходных последовательностей в базе данных генов с помощью программы "Megablast", доступной на вебсайте NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov.), показал, что секвенированный фрагмент длиной 872 пн, совпадающий у всех трех выявленных групп клубеньковых бактерий астрагала, полностью идентичен re^^S рРНК Agrobacterium tumefaciens IAM 14 (D13294), описанному Янаги и Ямасато [5]. На основе множественного выравнивания секвениро-ванных нами и взятых из международных баз данных EMBL/GenBank/DDBJ последовательностей генов 16S рРНК с помощью программы "MegAlign" пакета компьютерных программ "Lasergene" фирмы "DNASTAR, Inc.", (США) было построено филогенетическое древо бактерий семейства Rhizobi-aceae (рис. 2).
Схожесть генов 16S рРНК клубеньковых бактерий астрагалов и агробактерий отмечалась еще в работах Чена и соавт. [3, 4]. Изучая микросимбионты различных видов астрагалов (Astragalus adsurgens, A. complanatus, A. chrysopterus и A. scob-werrimus), они отмечали их большое филогенетическое разнообразие. Несколько изолятов было объединено в вид R. loessense. Как видно на рис. 2, данный вид образует единую монофилетическую ветвь с клубеньковыми бактериями Rhizobium ga-legae, вступающими в симбиоз с козлятником, и Rhizobium huautlense, заражающими Sesbania her-
bacea. До этого последние два вида бактерий объединяли с Agrobacterium vitis и велись дискуссии о возможности переноса данных ризобий в род Agrobacterium или даже выделении в отдельный род [6]. Однако при рассмотрении филогении ризобий обычно умалчивается, что этими же авторами были обнаружены, например, штаммы Rhizobium sp. SDW052 и Rhizobium sp. NM349, не получившие видового статуса, но тем не менее способные вступать в симбиоз с Astragalus adsurgens и идентичные по последовательностям генов 16S рРНК с Agrobacterium tumefaciens (рис. 2). Надо отметить, что, несмотря на различия в способе существования, род Agrobacterium входит в семейство Rhizobiaceae. Более того, введение симбиоти-ческих плазмид различных ризобий в лишенные Ti-плазмиды штаммы Agrobacterium tumefaciens приводило к тому, что агробактерии приобретали способность заражать бобовые растения, даже с образованием "эффективных" клубеньков [7]. Таким образом, почвенные сапротрофные формы агробактерий (Agrobacterium radiobacter), не имеющие Ti-плазмиды, являются потенциальными реципиентами симбиотических плазмид и теоретически способны "становиться ризобиями". Все более ясно, что способность вступать в симбиотические отношения с тем или иным бобовым растением, изначально являвшаяся критерием вида ризобий, в основном определяется набором симбиотических плазмид, а не их филогенией.
ФИЛОГЕНИЯ И ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ
131
Agrobacterium tumefaciens (D12784) Agrobacterium tumefaciens (D14500) L Rhizobium sp. SDW052 (AF345550) Agrobacterium tumefaciens (AB116668) Rhizobium sp. NM349 (AF345545) Agrobacterium tumefaciens (D13294) Rhizobium from Astragalus ciceri Agrobacterium rubi (D14503)
i
9.0
Rhizobium huautlense (AF025852) Rhizobium loessense (AF364069)
-Rhizobium galegae (D11343)
-Agrobacterium vitis (AB118158)
-Rhizobium giardinii (U86344)
Rhizobium etli (AY117632) Rhizobium leguminosarum (D14513) |- Rhizobium legum. bv. phaseoli (AY946012) L Rhizobium legum. bv. trifolii (U31074)
I-Agrobacterium rhizogenes (D14501)
1-Rhizobium tropici (D11344)
Rhizobium gallicum (U86343) Rhizobium mongolense (U89816) Mesorhizobium ciceri (AJ487829) Mesorhizobium loti (D14514)
- Mesorhizobium huakuii (D13431)
- Phyllobacterium myrsinacearum (D12790)
- Sinorhizobium fredii (D14516) Sinorhizobium meliloti (D14509)
- Bradyrhizobium elkanii (AF239845)
- Bradyrhizobium japonicum (X87272)
- Azorhizobium caulinodans (D11342)
0
Рис. 2. Древо сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК бактерий семейства Rhizobiaceae, построенное с помощью программы MegAlign пакета Lasergene (DNASTAR, США). На горизонтальной оси приведен вес данного выравнивания, выраженный в количестве замен нуклеотидов. Стрелкой показано филогенетическое положение исследованных штаммов бактерий.
Данная работа проводилась при частичной финансовой поддержке программы "Государственная поддержка ведущих научных школ России" (грант НШ-2217.2003.4, Госконтракт № 02.445.11.7018) и гранта РФФИ № 04-04-48884.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Allen O.N., Allen E.K. The Leguminosae. A source book of characteristics, uses and nodulation. Madison: Univ. Wisconsin Press, 1981. 800 p.
2. Chen W.X., Li G S, Qi YL, Wang E.T., Yuan H.L, Li J.L. Rhizobium huakuii sp. nov. isolated from the root nodules of Astragalus sinicus // Int. J. Syst. Bacteriol. 1991. V. 41. P. 275-280.
3. Gao J., Terefework Z, Chen W, Lindstrom K. Genetic diversity of rhizobia isolated from Astragalus adsurgens growing in different geographical regions of China // J. Biotechnol. 2001. V. 91. P. 155-168.
4. Wei GH, Tan Z.Y, Zhu ME, Wang E.T, Han S.Z, Chen W.X. Characterization of rhizobia isolated from legume species within the genera Astragalus and Lespede-za grown in the Loess Plateau of China and description of Rhizobium loessense sp. nov. // Int. J. Syst. Evol. Bacteriol. 2003. V. 53. P. 1575-1583.
5. Yanagi M, Yamasato K. Phylogenetic analysis of the family Rhizobiaceae and related bacteria by sequencing of 16S rRNA gene using PCR and DNA sequencer // FEMS Microbiol. Lett. 1993. V. 107. P. 115-120.
6. Wang E.T., van Berkum P., Beyene D, Sui X.H, Dorado O, Chen W.X., Martinez-Romero E. Rhizobium huaut-lens
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.