ОБЩАЯ ГЕНЕТИКА
УДК 575.86:599.322.2
ФИЛОГЕНИЯ И СИСТЕМАТИКА СУРКОВ (Marmota, Sciuridae, Rodentia), ОСНОВАННЫЕ НА ДАННЫХ интер^^-П^
© 2010 г. О. В. Брандлер1, Е. А. Ляпунова1, А. А. Банникова2, Д. А. Крамеров3
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук, Москва 119334;
e-mail: rusmarmot@yandex.ru
2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, кафедра зоологии позвоночных, Москва 119992 3Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва 119991
Поступила в редакцию 30.01.2009 г.
Филогенетические связи и таксономические отношения в роде сурков Marmota исследовали методом интер^ШЕ-ПЦР. Использовали праймеры, комплементарные консенсусным последовательностям двух коротких ретропозонов MIR и B1-dID. Полученные данные отражают длительную географическую изоляцию неарктических и палеарктических сурков, но не поддерживают подродово-го деления в связи со сравнительно низкими генетическими различиями между ними. Подтверждается выделение внутриродовых групп видов bobak и camtschatica, но не caudata. На основании сравнения различий митохондриального и ядерного геномов признается возможность давней гибридизации M. menzbieri и M. caudata. Находит подтверждение видовая самостоятельность M. kastschenkoi в составе предложенного надвида M. baibacina.
Голарктический род Marmota включает в себя формы, находящиеся на разных уровнях дифференциации. Среди них имеются хорошо морфологически и генетически дифференцированные симпатрические и семисимпатрические виды, ал-лопатрические виды и виды и формы, находящиеся на начальной стадии дивергенции. Неоднократные возникновения и исчезновения Берин-гийской суши, поддающиеся достаточно точной датировке, дают возможность определять время миграций и, соответственно, дивергенций некоторых форм. Имеющиеся палеонтологические находки сурков как в Старом, так и в Новом Свете позволяют сопоставлять данные генетического анализа с палеонтологической летописью. Все это делает сурков удобной модельной группой для изучения эволюционных процессов.
Филогении и систематике сурков посвящено достаточно много работ, основанных на анализе как классических морфологических признаков, палеонтологических данных и экологических особенностей [1—3 и др.], так и различий в звуковой сигнализации [4], кариотипических [5], биохимических [6] и иммуногенетических признаков [7]. Система рода Marmota разработана достаточно хорошо. Однако имеется ряд спорных вопросов, связанных с недостаточно четким диагнозом ряда таксонов, трансгрессией морфологических признаков и наличием переходных форм. В частности, таксономический статус форм baibacina, bobak, sibirica, himalayana, объединяемых различными авторами в разных комбинациях в так называемую группу bobak, является предметом длительной дискуссии систематиков с начала про-
шлого века до наших дней. Использование молекулярно-генетических маркеров стало в последнее время почти обязательным условием объективности филогенетических и таксономических заключений. Первые работы, посвященные суркам, выполненные с использованием метода ДНК-ДНК-гибридизации [8], позволили оценить время отделения сурков от основного ствола наземных беличьих. Широкое применение моле-кулярно-генетических маркеров для изучения филогении и систематики сурков было начато с секвенирования гена цитохрома b [9—11]. Позже М. Херрон и др. [12] использовали данные С. Степпана и др. [10] для построения филогении Sciuridae. Полученные на основании этого результаты в некоторых случаях противоречат сложившимся представлениям. Это касается внутри-родовой систематики и филогенетических отношений ряда форм. В частности, было предложено деление рода Marmota на два подрода Marmota и Petromarmota [10], при этом в состав первого, кроме всех палеарктических сурков, вошли M. monax и M. broweri, а во второй — все остальные неарктические сурки. Кроме того, "хорошие" морфологические виды M. caudata и M. menzbieri генетически оказались чрезвычайно близкими. Для объяснения этого феномена нами была выдвинута гипотеза давней гибридизации этих видов, оставившей след в митохондриальном геноме, к которому относится cyt b [13].
Последние исследования хромосомных наборов сурков внесли изменение в таксономию рода. На основании кариотипических особенностей была обоснована видовая самостоятельность
M. kastschenkoi (2n = 36), ранее считавшегося подвидом M. baibacina (2n = 38) [14]. При недостаточно четких морфологических отличиях оставался неизвестным уровень их генетической дивергенции. Кроме того, исследование кариотипов пале-арктических сурков показало их консервативность у наиболее морфологически и генетически дивергировавших видов [15].
Таким образом, молекулярная эволюция рода Marmota остается не до конца проясненной. Данные исследований митохондриального генома не соответствуют классическим представлениям, что возможно связано с известными ограничениями в применении митохондриальных маркеров. Темпы кариотипической, морфологической и митохондриальной эволюции сурков оказываются несопряженными, что требует введение в анализ независимых маркеров ядерной ДНК.
В настоящей статье представлены результаты исследования молекулярной изменчивости видов и внутривидовых подразделений рода Marmota методом полиморфизма длин участков ДНК, фланкируемых короткими диспергированными повторами, или SINEs. Данный метод мультило-кусного анализа ядерной ДНК интер^ШЕ-ПЦР (Inter-SINE-PCR) позволяет получить интегральную оценку изменчивости ядерного генома. Применимость этого метода для изучения филогенеза млекопитающих обоснована при изучении межвидовой таксономической структуры у насекомоядных, рукокрылых и приматов [16—18].
В данной работе основное внимание уделено филогенетическим связям палеарктических сурков, составу группы bobak, оценке генетических отличий M. menzbieri и M. caudata, а также внутри группы серых сурков. Кроме того, исследуется правомочность подродового деления Marmota.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе исследованы образцы от 51 особи 13 из 15 видов сурков мировой фауны (табл. 1). В качестве внешней группы в филогенетическом анализе использован длиннохвостый суслик Spermo-philus undulatus.
Выделение ДНК. ДНК выделяли из замороженных и хранившихся при температуре —80°С или фиксированных этанолом тканей (почки, печень и мышцы) методом фенол-хлороформной депро-теинизации после обработки гомогената тканей протеиназой К [19].
Условия интер-SINE-ПЦР. В данной работе использовали семейство SINE, называемое MIR (mammalian interspersed repeat), широко распространенное в геномах позвоночных [20], и семейство SINE B1-dID [21], свойственное грызунам семейств Sciuridae, Aplodontidae и Gliridae [22-24].
Интер-М1Я-ПЦР проводили с парой прайме-ров MIR17/MIL17. Их последовательности, условия амплификации и электрофоретического разделения меченных радиоактивным фосфором продуктов амплификации в полиакриламидном геле подробно описаны в предыдущих публикациях [16, 18].
В В1-ПЦР использовали праймер Mar17 — 5'-GCGCCACTACACCTGGC-3', комплементарный началу элемента B1-dID. B1-специфичную реакцию амплификации осуществляли при следующих условиях: денатурация — 94°С, 30 с; отжиг — 60°С, 45 с; синтез — 72°С, 2 мин. Число циклов — 27. Предварительная денатурация продолжалась 3 мин при 94°С; конечный синтез — 5 мин при 72°С. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации проводили так же, как и при интер-МЖ-ПЦР.
Филогенетический анализ. Фингерпринты, полученные в MIR- и В1-ПЦР, были преобразованы в бинарную матрицу (1 — присутствие полосы, 0 — отсутствие), которую анализировали методом максимальной экономии Вагнера (maximum parsimony — MP) в пакете PAUP 4.0b4a [25] и методами ближайшего связывания (neighbor-joining — NJ) и UPGMA в программе TREECONW [26]. Для оценки статистической достоверности группировок, получаемых методами NJ и MP, использовали бутстрэп-анализ по 1000 репликам. Генетические расстояния (DNL) рассчитаны по алгоритму Нея и Ли [27].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящей работе впервые для проведения интер-8ШЕ-ПЦР в качестве молекулярного маркера использован димерный ретропозон B1-dID. Полученные в результате применения этого маркера фингерпринты (рис. 1) позволили идентифицировать 94 признака, из которых 67 оказались парсимониально информативными.
Исследованные образцы сурков как на парси-мониальных, так и на дистанционных деревьях, построенных по результатам интер-MIR- и ин-тер-В1-ПЦР, группируются в соответствии со своей видовой принадлежностью. На всех деревьях выделяется группа, объединяющая североамериканских сурков. Низкие бутстрэп-под-держки для большинства узлов ветвления этих деревьев делают их неразрешенными для позиционирования большинства палеарктиче-ских видов. Объединение бинарных матриц ин-тер-MIR- и интер-В1-ПЦР позволяет получить суммарное дерево интер-8ШЕ-ПЦР для этих данных с более высокой бутстрэп-поддержкой, которое и обсуждается далее.
Топология суммарного парсимониального дерева (MP, 134 парсимониально информативных признака из общего числа 217) и дерева ближай-
Таблица 1. Характеристика изученного материала
Вид (подвид) Место отлова n Коллекционные номера (в скобках оригинальные номера коллекторов)
M. baibacina baibacina РФ, Алтай, Кош-Агачский р-н, 50 км к Ю-В от п. Кош-Агач, хребет Сайлюгем, р. Бураты; 49°30' с.ш., 88°30' в.д. 5 24429, 24430, 24431, 24432, 24433
M. b. centralis Казахстан, Алма-Атинская обл., хребет Кетмень, ущелье Большой Кокпак; 43° с.ш., 80° в.д. 2 23929, 23930
M. bobak bobak Украина, Харьковская обл., Великобурлукский р-н; 50° с.ш., 37°20' в.д. 2 23803, 23908
M. b. schagan-ensis Казахстан, Целиноградская обл., окр. п. Кургальджино; 50°30' с.ш., 70° в.д. 1 23991
M. b. kozlovi РФ, Саратовская обл., Вольский р-н, окр. п. Черкасское; 52°30' с.ш., 47°15' в.д. 2 24466, 24467
РФ, Саратовская обл., Вольский р-н, окр. с. Никольское, лев. берег р. Алай; 52°25' с.ш., 47°05' в.д. 1 24476
M. bobak ssp. РФ, Саратовская обл., Озинский р-н, окр. п. Модин; 51°15' с.ш., 49°30' в.д. 3 24458, 24459, 24461
РФ, Оренбургская
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.