ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 11, с. 1556-1564
^ ГЕНЕТИКА
РАСТЕНИЙ
УДК 582.333.3:575.86:575.852
ФИЛОГЕНИЯ РОДА Lophozia (Dumort.) Dumort. s. str. (Hepaticae) НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ЯДЕРНЫХ И ХЛОРОПЛАСТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ITS1-2 И TRNL-F
© 2007 г. А. А. Вильнет1, И. А. Милютина2, Н. А. Константинова1, М. С. Игнатов3, А. В. Троицкий2
1Полярно-алъпийский ботанический сад-институт Кольского научного центра Российской академии наук,
Мурманская обл., Кировск 184236; e-mail: anya_v@list.ru; nadya_k@aprec.ru
2Научно-исследователъский институт физико-химической биологии им. АН. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва 119992;
e-mail: tav@genebee.msu.su
3Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук, Москва 127276;
e-mail: misha_ignatov@list.ru
Поступила в редакцию 06.10.2006 г.
Филогенетические деревья, построенные методами максимальной экономии и максимального правдоподобия по объединенным нуклеотидным последовательностям ITS1-2 ядДНК и trnL-F хпДНК для 21таксона Lophozia s. str. и близких родов, Schistochilopsis (5 видов), Protolophozia elongata и Ob-tusifolium obtusum, имеют сходную топологию. Выявлено, что род Lophozia s. str., за исключением L. sudetica, является монофилетичным, L. sudetica заслуживает выделения в отдельный криптиче-ский род. Распределение видов в кладах не согласуется с секциями, рассматриваемыми на основе анатомо-морфологических данных. Взаимоотношения внутри рода Schistochilopsis соответствуют основанному на морфологических признаках делению рода на секции. Анализ молекулярных данных позволил уточнить систематическое положение ряда таксонов. Выявлена малая генетическая дивергенция географически удаленных форм.
Древнейшей группой из ныне существующих наземных растений являются печеночники, создание естественной классификации которых крайне затруднено в силу малого числа возможных для сравнительного анализа анатомо-морфологиче-ских признаков. Lophozia (Dumort.) Dumort. s. str. -один из наиболее полиморфных и трудных для определения родов печеночников, особенно в Арктике. Трактовка некоторых видов и внутривидовых таксонов неоднозначна, многие таксоны описаны сравнительно недавно и часто известны только из типового или еще нескольких местонахождений [1-4]. Как следствие, их изменчивость и филогенетические связи изучены очень слабо. В настоящее время наблюдается постепенный переход к более узкой трактовке рода Lophozia s. l. В отличие от представления об объеме рода R.M. Schuster [1], многие современные авторы признают выделение родов Leiocolea (Muell. Frib.) H. Buch и Barbilophozia Loeske [5-8]. Большинство российских исследователей придерживаются взглядов Р.Н. Шлякова [3], который, следуя узкой трактовке родов, предложенной скандинавскими ав-
торами [9, 10], выделяет в отдельные роды наряду с указанными выше также Isopaches H. Buch, Ob-tusifolium (H. Buch) S. Arnell, Orthocaulis H. Buch. Более того, Шляков поднимает до ранга рода подро-ды Massula K. Müll. emend R.M. Schust. и Protolophozia R.M. Schust. А.Д. Потемкиным поддержано выделение Schistochilopsis в качестве самостоятельного рода, но с включением в него Obtusifoli-um в качестве секции [11].
Доводы сторонников узкой и широкой трактовки родов, основанные на морфолого-анатоми-ческих признаках, вкратце рассмотрены в работе В.А. Бакалина [4]. Однако существующие аргументы недостаточно убедительны для принятия той или иной трактовки родов у Lophozia s. l. Ранее, основываясь на анализе нуклеотидных последовательностей trnL-F хлоропластной ДНК (хпДНК) 47 видов из семейства Lophoziaceae, было показано, что "узкая" трактовка родов в семействе, вероятно, более корректна [12]. В настоящей работе нами предпринята попытка оценить филогенетические отношения внутри Lophozia s. str. и близких к нему таксонов на основе анализа нук-
1556
леотидных последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров ядерной рДН^ (ITS1-2) и локуса trnL-F xпДHK значительно большего числа таксонов Lophozia s. str., а также наиболее близких к нему Schistochilopsis, Obtusifolium и Pro-tholophozia.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Отбор образцов. Для выделения ДHK использованы растения, отобранные из образцов гербария Полярно-альпийского ботанического сада-института (KPABG) Koльcкoгo научного центра PAH (таблица). В анализ включены 21 из 33 указанных для мира [4] таксонов рода Lophozia s. str., а также Schistochilopsis (5 видов), Protolophozia elongata и Obtusifolium obtusum. Виды Lophozia su-detica, L. silvicoloides, L. excisa, Schistochilopsis incisa и S. opacifolia представлены несколькими образцами, собранными в разных регионах. Anastrepta or-cadensis, Anastrophyllum michauxii, Sphenolobus saxicola использованы в качестве внешней группы.
Выделение ДНК и секвенирование. Выделение ДHK проводили с применением ЦTAБ [13] или с использованием набора для экстракции растительной ДHK - NucleoSpin Plant Kit ("Macherey-Nagel", Germany).
Для амплификации ITS1-2 и 5.8S pДHK использовали внешние и внутренние праймеры [14]. Для амплификации участка trnL-F использована пара праймеров, позволяющая получить полные последовательности интрона и З'-экзона гена trnL и спейсер между генами trnL и trnF [15].
Aмплификaцию осуществляли по схеме: 3 мин -94°C, 30 циклов (30 с - 94°C, 40 с - 58°C, 60 с - 72°C), 2 мин - 72°C. Полученные фрагменты ДHK анализировали путем электрофореза в 1%-ном ага-розном геле в 1xTAE с бромистым этидием и очищали с использованием набора реагентов GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit ("Amersham Bioscience", USA).
Определение нуклеотидных последовательностей Дж проводили методом циклического се-квенирования с использованием набора реагентов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 в Центре коллективного пользования "Геном" (Институт молекулярной биологии PAH им. ВА. Энгельгар-дта) с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДHK ABI PRISM 3100-Avant. Полученные последовательности депонированы в GenBank (таблица).
Филогенетический анализ. Выравнивание нуклеотидных последовательностей осуществляли вручную с использованием программы BioEdit [16].
Деревья строили методами максимальной экономии (MP) и максимального правдоподобия (ML) с помощью программ TNT [17] и PHYML [18] соответственно.
При работе с программой TNT использованы алгоритмы New Technology Search с 5-кратным повторением поиска минимальных деревьев и другими параметрами, предлагаемыми по умолчанию, и с 500 репликами джекнайфа при удалении 36% позиций. Для определения индекса поддержки Бремера использованы деревья с длиной больше минимальной на 20 шагов.
Для анализа программой PHYML использовали эволюционную модель нуклеотидных замен GTR + G + I, выбранную с помощью программы ModelGenerator [19], с 8 категориями гамма-распределения и 100 репликами бутстрепа. (Наш предыдущий опыт работы с последовательностями сходной длины показал, что значения бут-стреп-поддержки при увеличении числа реплик до 1000 отличаются от таковых при 100 репликах не более чем значения индекса бутстрепа, получаемые при независимых расчетах деревьев.)
РЕЗУЛЬТАТЫ
Последовательности ITS1-2 и trnL-F определены для 39 образцов. Дополнительно в анализ включены нуклеотидные последовательности trnL-F для Lophozia silvicola, L. sudetica, Schistochilopsis incisa и Obtusifolium obtusum, использовавшиеся в исследованиях, проведенных в наших лабораториях ранее [12].
Для филогенетического анализа последовательности ITS1-2 и trnL-F были объединены. ^мбинированные последовательности ITS1-2 и trnL-F для Lophozia polaris, L. silvicola, L. silvico-loides (Шпицберген), Obtusifolium obtusum созданы на основе материала разных образцов (см. таблицу). Оба образца Schistochilopsis incisa представлены только последовательностями участка trnL-F, а Lophozia sudetica (K41-5-04) - ITS1-2.
Общее выравнивание для 39 образцов состоит из 1416 пар нуклеотидов (пн), среди которых 57% позиций - консервативные, 39% - вариабельные, 27.5% - парсимониально-информативные. Участок trnL-F имеет большее число консервативных позиций по сравнению с ITS1-2 (69 и 51% соответственно), низкое количество вариабельных (28 и 46%) и парсимониально-информативных (20 и 32%). Нуклеотидный состав составляет 24.2% (T), 24.5% (C), 23.8% (A) и 27.5% (G).
Среди рода Schistochilopsis наименьшая длина ITS1-2 отмечена у S. capitata (787 пн), наибольшая -у S. opacifolia (832 пн). Среди Lophozia s. str. наименьший участок ITS1-2 у L. wenzelii var. groelandica (795 пн), а наибольший - у L. sudetica (04.06.1998) (821 пн). В целом длина участка ITS1-2 больше у представителей клады, сформированной L. excisa, L. propagulifera, L. polaris, L. polaris var. sphag-norum, L. longidens, по сравнению с другими вида-
Список таксонов, использовавшихся в исследовании, с указанием гербарных этикеток и номеров GenBank
Таксон Район сбора, коллектор, Номер генбанка
номер в гербарии KPABG trnL ITS
Anastrepta orcadensis (Hook.) Schiffn. Россия, Бурятия, H.A. Константинова, 59-1-01 DQ875088 DQ875126
Anastrophyllum michauxii (F. Weber) H. Buch Россия, Бурятия, H.A. Константинова, 17-1-02 DQ875087 DQ875125
Lophozia ascendens (Warnst.) R.M. Schust. Россия, Бурятия, H.A. Константинова, 109-3-01 DQ875054 DQ875089
Lophozia austro-sibirica Bakalin Россия, Бурятия, B.A. Бакалин, Б 15-9-99 DQ875069 DQ875105
Lophozia excisa (Dicks.) Dumort Шпицберген, H.A. Константинова, 104-1-04 DQ875056 DQ875091
Lophozia excisa (Dicks.) Dumort. Россия, Мурманская обл., H.A. Константинова, 41-2-97 DQ875057 DQ875092
Lophozia excisa (Dicks.) Dumort. Шпицберген, H.A. Константинова, K-21-2-05 DQ875058 DQ875093
Lophozia heteromorpha R.M. Schust. Россия, Камчатская обл., B.A. Бакалин, K-47-3-02 DQ875068 DQ875104
Lophozia cf. lacerata N. Kitag. Россия, Командорские о-ва, B.A. Бакалин, K-3-2-02-VB DQ875071 DQ875107
Lophozia lantratoviae Bakalin Россия, Бурятия, B.A. Бакалин, 76-7-01 DQ875055 DQ875090
Lophozia longidens (Lindb.) Macoun Россия, Мурманская обл., H.A. Константинова, 360-2-00 DQ875059 DQ875094
Lophozia polaris (R.M. Schust.) R.M.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.