Ш БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2014, том 40, № 6, с. 658-664
МИНИ-ОБЗОРНАЯ СТАТЬЯ
УДК 577.151
ФИТАСПАЗЫ: АСПАРТАТСПЕЦИФИЧНЫЕ АПОПТОТИЧЕСКИЕ
ПРОТЕАЗЫ РАСТЕНИЙ
© 2014 г. Н. В. Чичкова*, Р. А. Галиуллина*, Р. Е. Белошистов*, А. В. Балакирева**, А. Б. Вартапетян*' ** #
*НИИфизико-химической биологии им. А.Н. Белозерского **Факультет биоинженерии и биоинформатики, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва Поступила в редакцию 05.05.2014 г. Принята к печати 22.05.2014 г.
В обзоре рассмотрены структура и свойства недавно открытых аспартатспецифичных апоптотиче-ских протеаз растений — фитаспаз, в сравнении с апоптотическими протеазами животных — каспа-зами. Каспазы (цистеиновые протеазы) и фитаспазы (сериновые субтилизиноподобные протеазы) принципиально отличаются друг от друга в структурном отношении, однако обладают сходной субстратной специфичностью и ролью в осуществлении программированной клеточной смерти. Показано, что различия в структуре апоптотических протеаз животных и растений определяют различающиеся стратегии регуляции функционирования этих протеолитических ферментов у организмов двух царств.
Ключевые слова: протеазы, аспартатная специфичность, программированная клеточная смерть, каспазы, фитаспазы, растения.
DOI: 10.7868/S0132342314060062
ВВЕДЕНИЕ
Специфичность протеолитических ферментов определяется природой аминокислот, образующих гидролизуемую связь. Примечательно, что протеазы почему-то "не любят" гидролизовать пептидные связи в белках после остатка аспараги-новой кислоты (Asp). А таких протеаз, которые осуществляют гидролиз исключительно после аминокислотного остатка Asp, и вовсе известно совсем немного. Среди эндопептидаз строгой ас-партатной специфичностью гидролиза субстратов обладают убивающие клетку протеазы животных — каспазы и растений — фитаспазы.
АСПАРТАТСПЕЦИФИЧНЫЕ АПОПТОТИЧЕСКИЕ ПРОТЕАЗЫ
ЖИВОТНЫХ: КАСПАЗЫ И ГРАНЗИМ В
Свое название эта группа цистеиновых (или тиоловых) протеаз (MEROPS: клан CD, семейство C14) получила именно благодаря специфичности гидролиза: caspase, cysteine-dependent as-partate-specific protease [1]. Помимо редко встре-
Сокращения: ГО — гиперчувствительный ответ; ПКС — программированная клеточная смерть; Д& — 7-амино-4-трифторметилкумарин. #Автор для связи (тел.: +7 (495) 939-41-25; факс: +7 (495) 939-31-81; эл. почта: varta@genebee.msu.ru).
чающейся субстратной специфичности, каспазы обладают еще одним важным свойством — они на редкость избирательны в отношении белков. Среди десятков тысяч белков животной клетки каспазы гидролизуют лишь несколько сотен. Но даже и здесь каспазы проявляют исключительную разборчивость. Они вносят один, редко — два, разрыва в молекулу белка-мишени, несмотря на присутствие в белке десятков других остатков Asp.
Причина такой избирательности каспаз заключается в проявлении ими свойства вторичной специфичности, то есть в узнавании ферментами не только собственно остатка Asp, но и предшествующих ему трех (или четырех, как в случае кас-пазы-2, но это скорее исключение) аминокислотных остатков (положения Р4—Р2 субстрата) [2]. У млекопитающих имеется примерно 10 различных каспаз (в то время как у нематоды Caenorhabditis elegance — только одна), и эти ферменты отличаются по предпочитаемому мотиву узнавания в положениях Р4—Р2. Это не означает, что каждая кас-паза узнает лишь один свойственный только ей вариант аминокислотной последовательности. Сайт узнавания каждой конкретной каспазы вырожден, т.е. допускает в определенных пределах вариации аминокислотной последовательности в положениях Р4—Р2, хотя отклонение от оптимального мотива и может приводить к снижению эф-
фективности гидролиза. В то же время, в положении Р1 всегда, за единственным исключением, находится остаток Asp. Помимо этого, одна и та же аминокислотная последовательность может гидролизоваться разными каспазами (по крайней мере, in vitro).
Другой фактор, оказывающий влияние на избирательность гидролиза белков каспазами, — стерическая доступность сайта узнавания. Самый прекрасно узнаваемый каспазой аминокислотный мотив, будучи расположенным внутри молекулы белка-мишени или экранированным взаимодействующим белком, становится недоступным для гидролиза каспазой. Эти два обстоятельства — вырожденность сайтов гидролиза и необходимость стерической доступности сайта — делают поиск потенциальных белков-мишеней каспаз путем простого анализа их аминокислотных последовательностей занятием неблагодарным.
Общеизвестна роль ряда каспаз в осуществлении апоптоза, одной из форм программированной клеточной смерти (ПКС) у животных [3]. Фрагментируя ограниченный набор клеточных белков, каспазы осуществляют переключение клеток от жизни к упорядоченной гибели, сопровождающейся характерными морфологическими признаками. Другая группа каспаз принимает участие в формировании воспалительного ответа. В здоровых клетках каспазы не активны и гибели клеток не происходит, поскольку каспазы синтезируются и хранятся в цитозоле в виде неактивных белков-предшественников — прокаспаз. Процессинг прокаспаз (образование двух зрелых субъединиц, а и в, фермента) и активация происходят под действием проапоптотических стимулов. Существенно, что каспазы формируют каскад, в котором активация вышестоящих (инициа-торных) каспаз приводит к процессингу и активации нижестоящих (исполнительных) каспаз, которые и гидролизуют белки-мишени [4].
Другим примером протеолитического фермента, обладающего аспартатной специфичностью гидролиза, служит гранзим В [5]. Эта трип-синоподобная сериновая протеаза (MEROPS: клан РА, семейство S1) синтезируется клетками иммунной системы животных (натуральными киллерами и цитотоксическими Т-лимфоцита-ми). Гранзим В обладает субстратной специфичностью, сходной со специфичностью каспаз. В силу этого обстоятельства введение гранзима В клетками иммунной системы в инфицированные и трансформированные клетки (осуществляемое с помощью формирования специальной поры в клетках-мишенях) индуцирует в последних апо-птоз и приводит к их удалению.
АСПАРТАТСПЕЦИФИЧНЫЕ ПРОТЕАЗЫ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ РАСТЕНИЙ: ФИТАСПАЗЫ
ПКС реализуется и в организмах растений и используется для тех же целей, что и у животных: для удаления избыточных и поврежденных клеток, что способствует выживанию многоклеточного организма. Морфологические признаки ПКС у животных и растений имеют ряд общих черт, таких как сжатие клетки, фрагментация ДНК, выход цитохрома с из митохондрий, экспонирование фосфатидилсерина и т.д. [6—8]. Ключевая роль, исполняемая каспазами в осуществлении ПКС у животных, позволяла предполагать, что в клетках растений должны существовать гомологи каспаз, которые и участвуют в гибели растительных клеток. В соответствии с этой гипотезой, во многих моделях ПКС растений была обнаружена активация "каспазоподобных" протеаз, т.е. ферментов, способных гидролизовать синтетические пептидные субстраты каспаз [9]. Типичный флуорогенный субстрат такого рода имеет структуру X-X-X-D-Afc, где X — один из аминокислотных остатков, входящих в состав тетрапеп-тидного мотива узнавания определенной каспа-зы, а Afc — остаток 7-амино-4-трифторметил-ку-марина, начинающего флуоресцировать при отщеплении от пептидного компонента. Более того, инактивация этих не идентифицированных протеаз растений с помощью пептидных ингибиторов каспаз предотвращала развитие ПКС у растений, что свидетельствовало об участии этих протео-литических ферментов в осуществлении ПКС.
Однако секвенирование геномов растений показало, что прямых гомологов каспаз у растений нет, а наиболее близкие к каспазам в структурном отношении протеазы, названные метакаспазами, не обладают Asp-специфичной протеолитиче-ской активностью [10]. Поэтому неожиданно актуальным стал вопрос об идентификации протеаз растений, которые обладают субстратной специфичностью каспаз животных и участвуют в осуществлении ПКС у растений, но при этом структурно отличаются от каспаз.
Когда аспартатспецифичные протеазы растений, наконец, удалось охарактеризовать, выяснилось, что они относятся к семейству субтилизи-ноподобных сериновых протеаз (MEROPS: клан SB, подсемейство S8A, субтилазы) [11, 12] и принципиально отличаются по своей структуре от каспаз. Обнаруженные ферменты были названы фитаспазами (phytaspase, phyto — растительный (лат.), aspartate-specific protease) [11, 13]. Несмотря на кардинальные различия в строении активных центров, фитаспазы и каспазы обладают сходной субстратной специфичностью: фитаспа-зы гидролизуют субстраты строго после остатка Asp и, также как и каспазы, узнают в составе субстрата
660
ЧИЧКОВА и др.
Нумерация позиций: Р4 Р3 Р2 Pi
Структкра субстратов: Ac—X—X—X—D—Afc
5 -
и
ч
о р
идр
1-е
13
с
о р
о к С
4 -
3 -
2 -
1 -
5.0 5.0 50 50 50 5р 5р 50 50
^^ VV'V J? Ж /VV ^J* J>/
^ Г ^ ^ ^О
Флуорогенный субстрат
Рис. 1. Зависимость скорости гидролиза пептидных субстратов фитаспазой томатов от аминокислотного мотива, предшествующего остатку Asp (скорость гидролиза субстратов выражена в приросте флуоресценции, отн. ед./ч). Условия эксперимента: 20 мМ MES-буфер, pH 6.5; 2 мМ дитиотреитол; 0.1% твин 20; 5% глицерин; 0.5 М NaCl; 20 мкМ субстрат; 0.25 нМ фермент. Использованные флуорогенные пептидные субстраты (в представленном порядке) оптимальны для следующих каспаз человека: каспаза-1 (пептидный фрагмент субстрата — YVAD); каспаза-2 (VDVAD); кас-пазы-3 и -7 (DEVD); каспаза-5 (WEHD); каспаза-6 (VEID и VNLD); каспаза-8 (IETD); каспаза-9 (LEHD); все каспазы (VAD) [27, 28].
0
аминокислотные остатки в положении Р4—Р2, которые существенно влияют на эффективность гидролиза [11] (рис. 1). Лучшими из известных субстратов для фитаспаз различных растительных организмов являются Ac-VNLD-Afc и Ас-УЕГО-А1е (субстраты каспазы-6 человека), а Ac-DEVD-Afc (субстрат каспаз-3 и -7) не гидролизуется фитаспа-зами вовсе.
Фитаспазы не менее (а, пожалуй, даже более) избирательны, чем каспазы животных. Так, в настоящее время известен единственный белок-мишень фитаспаз — это белок VirD2 агробактерии А^гоЬас1егшт Штв/аавт, патогена растений. Фи-таспаза вноси
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.