БИОФИЗИКА, 2009, том 54, вып.2, c.343-381
ХРОНИКА = ==
УДК 577.3
ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
© 2009 г. И.Н. Сердюк
Институт бeлка PАН, 142290, ПущинoМосковской области; Объединенный институт ядерных исследований, 141980, ДубнаМосковской области П оступила в редакцию 07.08.2008 г.
Данный о бзор посвящен описанию со временно го состояния физико-химических методо в, испо льзуемых сегодня для изучения структурно-функциональных основ жизненных процессо в. Особое внимание уделено физическим методам, которые открыли новую страницу в иссле-до вании структуры биологических макромолекул. К ним относятся, в пер вую очередь, методы детектирования и манипулирования одиночными молекулами с применением оптических и магнитных ловушек. В обзоре также кратко изложены новые физические методы, такие как двумерная инфракрасная спектроскопия, флуоресцентная корреляционная спектроскопия и магнитно-резо нансная микроско пия. Путь, пройденный физико й и био ло гией за 55 прошедших лет, свидетельствует о то м, что не существует одно го единственного метода, обеспечивающего всю необходимую информацию о макромолекулах и их взаимодействиях. Каждый метод дает свое видение системы в пространстве и во времени. Все физические мето ды - комплементарны. Именно ко мплементар ность является основопо лагающей идеей, оправдывающей существо вание на практике всех физических методов, описание которых и было целью этого обзора.
Ключевые слова: структура и динамика макромолекул, гидродинамика и спектроскопия, рентгеновское и нейтронное рассеяние, оптическая и электронная микроскопия, ЯМР и масс-спек-трометрия, исследование одиночных молекул.
Официальным го дом рождения мо лекуляр-но й био логии считается 1953 г., когда Ф. К рик и Дж. Уо тсо н, испо льзуя данные по рассеянию рентгеновских лучей, предложили структуру ДНК в виде двойной спирали и на ее основе объяснили механизм воспроизведения жизни. Однако как новый раздел науки о на начала формироваться еще в тридцатые го ды прошлого столетия и с самого начала создавалась на основе экспериментальных мето дов физики. П о-следующее стано вление молекулярной биологии определялось развитием и со вер шенствованием как физических, так и химических методов исследования биологических объектов, поскольку изучение молекулярных механизмов генетических процессо в тесно связано со знанием молекулярной структуры веществ, в которых закодирована генетическая информация.
За это время были разработаны физические методы для исследования белков и РНК, го-
Сокращения: ЯМР - ядерный магнитный резонанс, NOE -эффект Оверхаузера, ЭМ - электронная микроскопия, КЭХ - капиллярная электрохроматография, ДЛП - двойное лучепреломление, ДРС - динамическое рассеяние света, ФКС - флуоресцентная корреляционная спектроскопия, ИЭР - ионизационное электрораспыление, ЛДПМ -лазерная десорбция с помощью матрицы, КД - круговой дихроизм, АСМ - атомно-силовая микроскопия, МРТ -магнитно-резонансная томография.
раздо более сложных в структурном отношении, чем ДНК. К ним относились седиментация, диффузия, вязкость, малоугловое рассеяние рентгено вских лучей и нейтронов, рентгено-структурный и нейтроноструктурный анализы, ядерный магнитный резонанс и электронная микроскопия. Эти методы позволили изучать структуру молекул с разным пространственным разрешением о т низкого, соответствующего размерам целой молекулы, до высо кого, соответствующего расстояниям между отдельными атомами в молекуле. Решающая роль в накоплении новых знаний о структуре и функционировании биологических молекул принадлежала и до сих пор принадлежит двум мето дам -рентгеновской кристаллографии и ядерному магнитному резонансу.
За последние годы появились также физические методы, открывшие новую страницу в исследовании структуры биоло гических макромолекул. К ним, в первую очередь, относятся методы детектирования одиночных молекул и манипулирования ими. На их основе совершен принципиальный переход от исследования макромолекул в больших объемах (доли миллилитр а) к исследованию макромолекул в предельно малых объемах (доли аттолитра). В связи с этим по явилась возможность перейти о т описания свойств ансамбля макромолекул к
описанию свойств одиночных макромолекул. Н е сбылось предсказание великого Ш редингер а о том, что мы никогда не сможем работать с одиночными электронами, атомами и молекулами. Сего дня с помощью ко нфокальной микроскопии и микроскопии ближнего поля можно детектировать флуоресцентно меченые о диноч-ные молекулы, с помо щью микроскопии сило-во го поля визуализовать одиночные молекулы, с помощью оптических и магнитных ловушек растягивать, расстегивать, скручивать, раскручивать биологические макромолекулы. В результате применения этих методов появилась уникальная возможность визуализации и о писания работы линейных и роторных биологических моторов в тер минах сил (пиконьютоны) и расстояний (нанометры), сопровождающих каждую фазу их рабочего цикла. Все это привело к появлению но во го тер мина «сила» для описания механики био логических мо лекул. В повседневную практику вошли такие величины, как атто- и зептомоль, составляющие 10-18 и 10-21 моля соответственно, которые ранее на практике не использовались.
Физика - быстро развивающаяся наука. Об этом свидетельствует по явление со вер шенно новых методов исследования структуры макромолекул, из которых в этом обзоре будут упо мя-нуты: двумер ная инфракра сная спектроско пия, которая может рассматриваться как аналог двумерного ядерного магнитного резонанса в оптической области, флуоресцентная корреляционная спектроскопия, которая является развитием метода динамического рассеяния света для случая негауссовой статистики (малое число частиц), и магнитно-резонансная микроскопия, являющаяся интеграцией атомно-силовой микроскопии и ядерного магнитного резонанса.
В обзоре главное внимание уделяется современному состоянию биофизических методов, с кратким описанием основных физических ко н-цепций, лежащих в их основе. Читатели, интересующиеся подробностями истории их развития, фундаментальными зако нами, а также подробными результатами, по лученными за последние по лвека, отсылаются к недавно вышедшей книге [1].
1. РЕНТГЕН ОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ
П ер вые кристаллы белков были получены в 1930-е годы. Однако только к 1957 году М. Перутц, а вслед за ним Дж. Кендрю нашли путь к решению фазовой проблемы в белковой кристаллографии, используя производные с тяжелыми атомами. Проблемы, связанные с кри-
сталлизацией белков (всего несколько исследователей в мире умели это делать), и тяжелый тр уд кристаллографических вычислений сам по себе (это была до компьютер ная эр а и все р ас-четы выполнялись вручную) обрекали белковую кристаллографию на получение информации о трехмерной структуре очень немногих биологических макромолекул.
М етод рентгеновской кристаллографии долгое время не рассматривался как основной структурный метод молекулярной биологии. П ричин для этого было много, главная из них заключалась в большо й трудоемкости метода. Физики в это время в качестве источников рентгеновского излучения использовали рентгеновские трубки, мощность которых составляла всего несколько киловатт, и, как следствие этого, набор дифракционной картины занимал многие месяцы или годы. М ощности компью-теро в также оставляли желать мно го лучшего.
Ситуация кардинально изменилась к середине 80-х годо в, когда по явились первые исто чники синхро тронного излучения, мощности которых на многие порядки превосходили мощности рентгено вских трубо к. И х использо вание в рентгеноструктурном анализе, наряду с активным внедрением в научную жизнь политики «по CTystall - по grant» [2], привело к то му, что число расшифрованных белковых структур стало быстро расти. Это увеличение началось в середине 1988 го да, и если до этого в Банк белковых структур поступало всего две-три структуры в месяц, то в 1997 году их число составило пять структур в день. А к нынешнему дню это число возросло почти на порядок.
Рентгеновская кристаллография развивается стремительными темпами. Разработаны новые методы решения фазовой проблемы: метод аномальной дисперсии, фазирование с использованием данных других методов (электронная микроскопия, нейтронная дифр акция), метод молекулярного замещения, прямые методы [3,4]. В строй вводились все новые более мощные син-хро тронные исто чники [5], но вые быстродействующие детекторы [6]. Все это привело к тому, что время от начала сбора данных и до получения первых карт электронной плотности стало стремительно уменьшаться. Так, получение первой карты электронной плотности белка МоёЕ из E. coli методом аномальной дисперсии на селенметионино вых произво дных этого белка на камере BM14 синхро трона ESRF в Гре-но бле в 1997 году заняло 7 часов. Сегодня это время составляет менее одного часа и несомненно в дальнейшем будет еще меньше [7]. Атом селена сегодня получил широкое распространение для решения фазовой проблемы вви-
Рис. 1. Девять основных мотивов сворачивания в мире глобулярных белков: «глобиновый», «трилистник», «вверх-вниз», «греческий ключ», «а-Р-сэн-двич», «мягкий рулет», «двойное крыло», «а-Р-ру-лет», «бочонок» [18].
ду возможности получения селенметиониновых производных непосредственно в процессе получения рекомбинантного белка. Введенные за последние годы в строй несколько новых син-хротронных источников имеют яркость на несколько порядков большую, чем предыдущие, и в сто раз превосходят яркость Солнца.
Увеличение интенсивности пер вичного пучка, достигаемое при использовании синхротрон-ных источников, позволяет работать с микрокристаллами, объем которых может составлять менее тысячных долей мм3. В перспективе просматривается использование пульсирующих синхротронных источников, открывающих уникальные возможности для дифракционного структурного «кино» [8].
Достижения рентгеновской кристаллографии особенно ощутимы в решении задачи века -определении структуры рибосомы. Получение в 1991 г. кр исталло в асимметричной по форме большой (50Б) рибосомной субчастицы, которые дифрагировали до 3,0 А, фактически поло
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.