ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2013, том 451, № 2, с. 225-227
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.112.083+577.322.63
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА УРИДИНФОСФОРИЛАЗЫ ИЗ SHEWANELLA ONEIDENSIS MR-1
© 2013 г. Н. Н. Мордкович, Т. Н. Сафонова, В. А. Манувера, В. П. Вейко, К. М. Поляков, К. С. Алексеев, С. Н. Михайлов, член-корреспондент РАН В. О. Попов
Поступило 30.01.2013 г.
Б01: 10.7868/80869565213200279
Уридинфосфорилаза (УФ) (КФ 2.4.2.3) принадлежит к классу нуклеозидфосфорилаз, играющих важную роль в метаболизме нуклеозидов [1]. В опухолевых клетках наблюдается повышенный уровень активности этих ферментов, которые могут быть использованы в качестве маркёров онкологических заболеваний [2]. Эти ферменты при-
меняются в промышленности для синтеза лекарственных препаратов и практически важных нуклеозидов [3]. Нуклеозидфосфорилазы осуществляют обратимый фосфоролиз нуклеозидов с образованием соответствующего гетероциклического основания и (2-дезокси)рибозо-1-фосфата, при этом равновесие реакции сдвинуто в сторону нуклеозидов
ИОп B
О
+ ИО-Р-ОИ ОИ
ИО
ИО R
B — гетероциклическое основание; R = ОИ, И.
Уридинфосфорилазы обнаружены почти у всех организмов, при этом гомология между ферментами Escherichia coli и млекопитающих менее 25% [4]. К настоящему времени выделены и охарактеризованы УФ из разных организмов [5—7]. Наиболее изученным является УФ из E. coli (ЕУФ), представляющая собой гомогексамер, каждая субъединица которого состоит из 253 аминокислотных остатков и имеет массу 27.5 кДа [8]. Следует отметить, что все хорошо изученные УФ протеобактерий выделены из паразитических видов.
Таким образом, представляет интерес изучение УФ из свободноживущей бактерии Shewanella oneidensis MR-1 ^УФ), относящейся к классу
Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской Академии наук, Москва Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской Академии наук, Москва Научно-исследовательский институт физико-химической медицины, Москва Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт", Москва
B +
ИО R
О-Р-ОИ,
ОИ
у-протеобактерий и являющейся факультативным анаэробом [9].
В настоящей работе представлены результаты физико-химического исследования рекомби-
60 г
50
40
£
о о я <ч
£
30-
20-
10-
35 40 45 50 55 60 Температура, °C
Рис. 1. Зависимость активности SУФ от температуры.
226
МОРДКОВИЧ и др.
pH
Рис. 2. Зависимость активности 8УФ от значений pH.
нантной УФ из 8. опе1ёеп818 МЯ-1. Уридинфос-форилаза из этого источника выделена и охарактеризована впервые.
Экспрессия гена ыёр из 8. опе1ёеп818 МЯ-1 ^епВапк GQ294526) была проведена в штамме-реципиенте Е. еоИ, рекомбинантный белок выделен и очищен, как описано в [10]. Мономерная субъединица 8УФ состоит из 252 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 27 кДа. Сравнение первичных структур 8УФ и ЕУФ выявило гомологию 76%.
Для подтверждения гексамерной структуры 8УФ проведена гель-фильтрация. Температурный оптимум 8УФ определяли в диапазоне 30—60°С с шагом 5°С в 10 мМ калий-фосфатном буфере рН 7.4; рН оптимум 8УФ определяли в диапазоне рН 6.0—8.0 с шагом 0.5 ед в 10 мМ калий-фосфатном буфере при 37°С. Активности 8УФ измеряли по отношению к уридину согласно [1]. На рис. 1 и 2 представлены графики зависимости активности 8УФ от температуры и рН. Определение констант Михаэлиса (ХМ) уридина (№ё), 2'-дезоксиуриди-на (ёигё), тимидина (ТИё) и 5-метилуридина (Ме№ё) проводили спектрофотометрически, как описано в работе [11]. В табл. 1 приведены физико-химические параметры 8УФ и ЕУФ. Константы Михаэлиса для этих ферментов практически
Рис. 3. Кристаллы уридинфосфорилазы в комплексе с уридином.
совпадают. Из данных табл. 1 видно, что 8УФ имеет более высокий температурный оптимум, чем ЕУФ при таком же значении рН-оптимума. В последнее время термостабильность ферментов привлекает повышенное внимание исследователей, поскольку она является важной характеристикой, определяющей возможность использования фермента в биотехнологическом синтезе [12].
Для выяснения факторов, обусловливающих различия в термостабильности 8УФ и ЕУФ, а также с целью выяснения архитектуры активного центра фермента необходимо детальное представление о трехмерной структуре фермента. Для решения этих задач были получены кристаллы рекомбинантной 8УФ в свободном состоянии и в комплексе с субстратом (уридином) [13]. Кристаллы 8УФ в комплексе с уридином показаны на рис. 3.
Благодаря высокому качеству кристаллов удалось собрать наборы дифракционных данных с
Таблица 1. Физико-химическая характеристика уридинфосфорилаз из E. coli и S. oneidensis MR-1
Организм KM, мкмМ T °C J опт > ^ рНопт
Urd dUrd Thd MeUrd
E. coli S. oneidensis MR-1 80 82 133 121 270 215 65 65 37 [12] 55 7.5 [1] 7.4
Примечание. Кинетические параметры для ферментативного фосфоролиза УФ уридина и его производных, измеренные спектрофотометрически: 50 мМ калий-фосфатный буфер рН 7.5, температура 25°С.
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 451 № 2 2013
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
227
высоким разрешением (0.95 и 1.6 А для 8УФ в свободном состоянии и в комплексе соответственно) и с использованием синхротронного излучения. Такая точность позволит проанализировать тонкие структурные детали фермента и выявить различия между структурой фермента в свободном состоянии и в комплексе с субстратом, что в дальнейшем послужит основой для определения и детализации механизма действия ферментов этого важного класса, участвующих в метаболизме нуклеозидов.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (государственный контракт № 16.512.11.2174), РФФИ (гранты 12-04-90036-Бел_а и 12-04-32197мол_а) и РАН (программа "Молекулярная и клеточная биология").
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Leer J.C., Hammer-Jespersen K., Schwartz M. // Europ. J. Biochem. 1977. V. 75. P. 217-224.
2. Watanabe S., Uchida T. // Biochem. and Biophys. Res. Communs. 1995. V. 216. P. 265-272.
3. Михайлопуло И.А., Мирошников А.И. // Acta natur. 2010. Т. 2. С. 38-61.
4. Pugmire M.J, Ealick S.E. // Biochem. J. 2002. V. 361. Р. 1-25.
5. Takehara M., Ling F., Izawa S., Inoue Y., Kimura A. // Biosci. Biotech. Biochem. 1995. V. 59. Р. 1987-1990.
6. Вейко В.П., Чеботаев Д.В., Овчарова И.В., Гуль-коЛ.Б. // Биоорган. химия. 1998. Т. 24. С. 381-387.
7. Zolotuchina M., Ovcharova I., Eremina S., Errais Lopes L., Mironov A.S. // Res. Microbiol. 2003. V 154. Р. 510-520.
8. Walton L., Richards C.A., Elwell L.P. // Nucl. Acids Res. 1989. V 17. Р. 6741.
9. Myers C.R., Nealson K.H. // Science. 1988. V. 240. Р. 1319-1321.
10. Мордкович Н.Н., Манувера В.А., Вейко В.П., Деба-бов В.Г. // Биотехнология. 2012. № 1. C. 21-30.
11. Панова Н.Г., Щевелева Е.В., Алексеев К.С., Мухор-тов В.Г., Зуев А.Н., Михайлов С.Н., Есипов Р.С., Чу-виковский Д.В., Мирошников А.И. // Молекуляр. биология. 2004. Т. 38. № 5. C. 907-913.
12. Visser D.F., Henessy F., Rashamuse J., Pletschke B., Brady D. // J. Mol. Catal. B: Enzymatic. 2011. V. 68. Р. 279-285.
13. Safonova T.N., Mordkovich N.N., Polyakov K.M., Manuvera V.A., Veiko V.P., Popov V.O. // Acta cryst. F. 2012. V. 68. Р. 1387-1389.
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 451 № 2 2013
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.