БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 6, с. 856 - 860
УДК 577.152
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ БАКТЕРИЙ Rhodopseudomonas palustris штамм f8pt
© 2006 г. А.Т. Епринцев1*, М.И. Фалалеева1, М.А. Климова1, Е.И. Компанцева2
1 Воронежский государственный университет, 394006Воронеж, Университетская пл., 1; факс: (4732)209-755, электронная почта: bc366@bio.vsu.ru 2 Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, 117811 Москва, Пр. 60-летия Октября, 7, корп. 2; факс: (495)135-6530, электронная почта: elenamaxi@mail.ru
Поступила в редакцию 14.12.05 После доработки 07.02.06
Из Rhodopseudomonas palustris штамм f8pt получены электрофоретически гомогенные изоформы малатдегид-рогеназы с разной четвертичной структурой, экспрессируемые при фотолитогетеротрофном росте на мала-те и ацетате. Методом избирательного ингибирования цикла трикарбоновых кислот или глиоксилатного цикла показано, что димерная форма фермента обеспечивает функционирование цикла Кребса, а тетрамер-ная участвует в работе глиоксилатного цикла.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: малатдегидрогеназа, очистка, димер, тетрамер, каталитические свойства.
Малатдегидрогеназа (МДГ, КФ 1.1.1.37.) является полифункциональным ферментом, обеспечивающим протекание как энергетического, так и конструктивного обменов. Ранее в наших работах выявлена роль структурно-функциональных перестроек МДГ у бесцветной серобактерии Beggiatoa leptomitiformis при смене типа питания от органотрофного на литотрофный [1—3]. Мы показали, что димер МДГ участвует в функционировании цикла трикарбоновых кислот (ЦТК), тогда как тетрамер — в функционировании глиоксилатного цикла.
Давно известно, что у фототрофных анаэробов, таких как Rhodobacter capsulatus, Rhodospir-illum rubrum, Rhodomicrobium vannielii, в конструктивном метаболизме функционирует тетрамер-ная форма МДГ [4]. Бактерии Rhodopseudomonas palustris характеризуются наибольшей вариабельностью метаболизма и способны осуществлять все типы питания [5]. Активность ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла выявлена в них при всех типах питания [6]. При переходе от одного типа питания к другому в клетках бактерий происходит изменение соотношения роли
Принятые сокращения: МДГ — малатдегидрогеназа, ЦТК — цикл трикарбоновых кислот, СДГ — сукцинатде-гидрогеназа, БСА — бычий сывороточный альбумин.
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
ЦТК и глиоксилатного цикла. Известно, что при культивировании на среде, содержащей ацетат, в бактериях индуцируется глиоксилат-ный цикл, а при использовании малата — ЦТК [6, 7]. Представляет интерес исследование структурной организации малатдегидрогеназ-ной ферментной системы в R. palustris штамм f8pt в условиях функционирования в бактериях каждого из метаболических путей. Для бактерий невозможен изоферментный полиморфизм за счет различной субклеточной локализации, как в клетках эукариот [8]. Следовательно, участие МДГ в разных метаболических процессах у бактерий может обеспечиваться структурными изменениями белковой молекулы [1, 3, 9]. В связи с этим целью нашей работы являлось получение гомогенных препаратов МДГ из R. palustris штамм f8pt в условиях миксотрофного роста и изучение ее физико-химических свойств.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования служили пурпурные несерные фототрофные бактерии R. palustris штамм f8pt. Для выращивания использовали питательную среду Пфеннинга [10] следующего состава (г/л): KH2PO4 - 0,33, MgCl2 ■ 6H2O -0,33, MnCl2 ■ 4H2O - 0,33, Na2SO4 - 0,33, KCl -
0,33, CaCl2 ■ 2H2O — 0,1, дрожжевой экстракт «Difco» — 0,1, малат натрия — 0,5 («Sigma», США), ацетат натрия — 0,5 («Serva», ФРГ), Na2S2O3 — 2,0, дистиллированная вода, рН среды 7,6. После стерилизации вносили витамины и микроэлементы [11]. Клетки осаждали центрифугированием при 8000 g в течение 15 мин, промывали 0,05 М Tris-HCl-буфером, рН 7,5 и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора УЗДН-2Т при мощности 500 Вт и частоте 22 кгц в течение 2 мин в ледяной бане. Клеточный дебрис осаждали центрифугированием при 4000 g в течение 5 мин при 4°.
Активность МДГ определяли спектрофото-метрически на СФ-46 по изменению поглощения при 340 нм за счет образования или расходования NADH [12]. При определении скорости восстановления оксалоацетата среда содержала 50 мМ Tris-HCl-буфер, рН 8,0, 1,5 мМ оксало-ацетат, 0,15 мМ NADH. Измерение активности МДГ в прямой реакции проводили в реакционной среде следующего состава: 50 мМ Tris-HCl-буфер, рН 9,0, 4 мМ малат, 1 мМ NAD+. За единицу активности МДГ принимали количество фермента, превращающее (в обратной реакции) или образующее (в прямой реакции) 1 мкмоль NADH за 1 мин при 25°. Определение общего количества белка проводили по методу Лоури и др. [13].
Для очистки МДГ использовали трехстадий-ную схему, включавшую фракционирование сульфатом аммония (45—80%), гель-фильтрацию через колонку (1,5 х 20 см) с Сефадексом G-25 («Pharmacia», Швеция) и ионообменную хроматографию на колонке (1,5 х 12 см) с DEAE-Toyopearl («Toyosoda», Япония) [14]. Элюцию проводили ступенчатым градиентом концентрации KCl 25—30 мМ (для тетрамера МДГ) и 45-50 мМ (для димера МДГ).
Для определения четвертичной структуры и молекулярной массы нативной МДГ использовали гель-хроматографию через колонку (2 х 40 см) с Сефадексом G-200 [14]. Определяли объем его выхода (Ve). Свободный объем (V0) колонки определяли с помощью голубого декстрана («Serva»). Молекулярную массу изучаемого фермента определяли по формуле, полученной из калибровочного графика:
lg Mr = 6,698 - 0,987 (V/Vo) . (1)
Электрофорез нативной МДГ проводили в полиакриламидном геле (9%) по модифицированному методу Девиса [15]. Для специфического проявления использовали тетразолиевый метод [16], для универсальной окраски на белок — методику с нитратом серебра [17]. Ds-Na-ПААГ-
электрофорез осуществляли при концентрации полиакриламидного геля 12,5%. Каждый образец содержал 3—5 мкг белка. Для построения калибровочной кривой использовали стандартные маркерные белки («Sigma») (кДа): целлюлаза — 94,6, БСА — 66,2, карбоангидраза — 31,0, ингибитор трипсина — 21,5 [18].
Для ингибиторного анализа использовали ингибитор сукцинатдегидрогеназы (один из ключевых ферментов ЦТК) — малонат в концентрации 5 мМ и ингибитор изоцитратлиазы (ключевой фермент глиоксилатного цикла) — итако-нат в концентрации 3 мМ, которые добавляли в среду культивирования бактерий [19].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
С помощью электрофореза в ПААГ было установлено наличие двух изоформ МДГ у R. palustris штамм f8pt в условиях фотолитогетеро-трофного роста на ацетате натрия и малате натрия (рис. 1, I).
Р ^
Р ^
Рис. 1. Электрофореграммы МДГ, очищенной из R. palustris штамм f8pt, культивируемых фотолитогетеротрофно на ацетате и малате. I — Специфическое проявление МДГ из гомогената бактерий; II — окрашивание нитратом серебра МДГ после ионообменной хроматографии на DEAE-Toyopearl (пик 1 и пик 2). Р — Белковая полоса
858
ЕПРИНЦЕВ и др.
Удельная активность полученных гомогенных изоформ МДГ из R. palustris меньше, чем у аналогичных ферментов из Beggiatoa leptomitiformis. Так, удельная активность димерной формы фермента из B. leptomitiformis составила 24,5, а тетра-мерной 20,4 E/мг белка. МДГ, выделенная из бактерий Leucothrix mucor, растущих органо-трофно, обладает удельной активностью 1,2 Е/мг белка, тогда как при литотрофном росте она составляет лишь 0,56 Е/мг белка. Следовательно, удельная активность МДГ сильно варьирует в зависимости от источника выделения фермента [2].
При гель-хроматографии на Сефадексе G-200 МДГ элюировалась в виде двух пиков, соответствующих молекулярным массам 90 и 180 кДа. Электрофоретическое исследование белка в присутствии Ds-Na позволило определить величину молекулярной массы одной субъединицы, которая составила 47 кДа в обоих случаях (рис. 2). Интересно, что размер субъединицы достаточно
Рис. 2. Определение молекулярной массы субъединицы МДГ методом Ds-Na-электрофореза: 1 — субъединица ди-мерной изоформы МДГ, 2 — субъединица тетрамерной изоформы МДГ
Для бактерий R. palustris характерен мобильный тип метаболизма, определяемый условиями культивирования, что и дало возможность выявить наличие двух изоформ фермента при фото-литогетеротрофном росте. Для многих пурпурных несерных бактерий (R. capsulatus, R. rubrum, R. vannielii) характерна только тетрамерная форма фермента [4].
С помощью трехстадийной очистки были получены ферментные препараты двух изоформ МДГ с удельной активностью 1,61 и 1,55 Е/мг белка при культивировании R. palustris фотоли-тогетеротрофно на ацетате натрия и малате натрия соответственно (табл. 1). Определяющей стадией очистки, позволившей разделить изо-формы МДГ, стала ионообменная хроматография через DEAE-Toyopearl. Проведенный электрофоретический анализ очищенных препаратов показал, что в полиакриламидном геле при универсальном окрашивании на белки и специфическом проявлении обнаруживалось по одной белковой полосе с Rf 0,11 и 0,34 (рис. 1).
Рис. 3. Электрофореграммы МДГ, очищенной из бактерий, культивируемых фотолитогетеротрофно на ацетате и малате: 1 — без ингибиторов, 2 — в присутствии малоната, 3 — в присутствии итаконата; на ацетате: 4 — без ингибиторов. Р — Белковая полоса, F — фронт красителя бромфенолового синего
Таблица 1. Очистка МДГ из бактерий R. palustris штамм f8pt, выращенных фотолитогетеротрофно на ацетате и малате натрия
Стадии очистки Общий объем, мл Белок, мг/мл Удельная активность, Е/мг Выход,%
Гомогенат 12,5 604 0,035 100
Супернатант 8,8 277 0,038 48,5
Фракционирование (МН4^04 4 92 0,065 28,0
Гель-фильтрация 3 38 0,103 18,1
Ионообменная хроматография:
пик 1 2 0,50 1,61 3,8
пик 2 2 0,49 1,55 3,5
сильно варьирует и составляет 39 кДа у L. mucor и 58 кДа у Vulcanithermus medioatlanticus [20, 21]. Результаты гель-хроматографии и Ds-Na-элект-рофореза показывают, что в R. palustris МДГ представлена двумя формами: димером и тетра-мером, что характерно и для других видов бактерий, способных к миксотрофному росту [1— 3].
На гомогенных препаратах фермента выявлены некоторые различия в каталитических характеристиках
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.