МЕДИЦИНСКИЕ == ПОЛИМЕРЫ
УДК 541.64:54
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПОЛИАМФОЛИТОВ - КВАТЕРНИЗОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ПОЛИ-4-ВИНИЛПИРИДИНА1
© 2013 г. Т. А. Ситникова, А. А. Рахнянская, Е. Г. Ярославова, Н. С. Мелик-Нубаров, А. А. Ярославов
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова.
Химический факультет 119991 Москва, Ленинские горы Поступила в редакцию 19.04.2012 г.
Принята в печать 01.11.2012 г.
Путем модификации поли-4-винилпиридина ю-бромкарбоновыми кислотами и бромистыми алки-лами синтезированы три типа полиамфолитов: с катионными и анионными группами в каждом звене (полибетаины), с бетаиновыми и катионными звеньями и с бетаиновыми звеньями и боковыми цетильными радикалами. Исследовано их комплексообразование с липосомами, сформированными из цвиттер-ионного (электронейтрального) фосфатидилхолина и анионного дифосфатидилгли-церола (кардиолипина). Способ закрепления полимеров на липосомальной мембране и стабильность образующихся комплексов определяется химическим строением макромолекулы. Полиэлектролиты электростатически адсорбируются на мембране и полностью удаляются с нее при увеличении концентрации соли в окружающем растворе. Исключение составляет полибетаин, полученный модификацией поли-4-винилпиридина ю-броммасляной кислотой, который связывается с липосомами необратимо, по-видимому, за счет встраивания фрагментов макромолекулы в гидрофобную часть липидного бислоя. Введение в молекулу полибетаина боковых цетильных радикалов стабилизирует его комплекс с липосомами в присутствии соли. Цитотоксичность синтезированных полиамфолитов на один—два порядка ниже цитотоксичности катионного полимера той же степени полимеризации.
Б01: 10.7868/80507547513030100
В последние десятилетия водорастворимые полимеры с катионными группами нашли применение в качестве иммуностимуляторов [1—5], антимикробных препаратов [6—10], средств внутриклеточной доставки генетического материала [11—13]. Это заставило обратиться к исследованию поведения катионных полимеров в биологическом окружении и, в частности, к изучению механизмов их взаимодействия с клетками. Для анализа биологических аспектов такого взаимодействия — (цито)токсичности и иммуностимулирующих свойств поликатионов, повышения трансформирующей активности ДНК путем связывания ее в комплекс с катионными полимерами — были использованы культуры клеток и экспериментальные животные [1— 13]. Для изучения физико-химических аспектов (влияния поликатионов на мембранный транс-
1Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (коды проектов 11-03-00936 и 11-03-92487).
E-mail: yaroslav@genebee.msu.ru (Ярославов Александр Анатольевич).
порт (поли)ионов и незаряженных веществ, структурную организацию липидного бислоя и активность мембранных белков) наряду с клетками применяли модельные системы — сферические бислойные везикулы (липосомы), сформированные из индивидуальных липидов и/или их смесей. Оказалось, что катионные полимеры эффективно адсорбируются на поверхности клеток [14] и анионных липосом [15—18], и полученные комплексы сохраняются в растворе с концентрацией соли №С1, равной 0.15 моль/л [19, 20]. Вместе с тем поликатионы демонстрируют довольно высокий уровень цитотоксичности [21, 22], что может быть связано с их способностью взаимодействовать с анионными компонентами клеточной мембраны (ферментами, рецепторами, кана-лообразователями и т.д.) и тем самым оказывать влияние на функционирование клетки [23, 24].
Сказанное выше указывает на необходимость поиска новых полимеров, которые эффективно адсорбируются на клеточной мембране и при этом демонстрируют минимальную цитотоксич-ность. Поликарбоксибетаины, полученные алки-лированием поли-(4-винилпиридина) ю-бром-
Состав исследованных полиамфолитов
Группа полимеров Полимер а Р У 5
ПБЕТ-1 0.98 - - 0.02
ПБЕТ-2 0.98 - - 0.02
к т ПБЕТ-3 0.70 - - 0.25
ПБЕТ-4 0.68 - - 0.32
У ПБЕТ-5 0.73 _ - 0.27
N N ПБЕТ
(¿и2)и
соо-
а = к/(к + ш), 8 = ш/(к + ш)
ПБК-1 0.80 0.16 - 0.04
ПБК-2 0.58 0.28 - 0.04
к 1 т ПБК-3 0.50 0.45 - 0.05
ПБК-4 0.39 0.57 - 0.04
J ^ +J ч ПБК-5 0.33 0.63 _ 0.04
N 1 N Бг-1 N ПБК-6 0.06
— 0.94 -
(СИ2)2 СИ2 1 ПБК
соо- СИз
а = к/(к + 1 + ш), в = 1/(к + 1 + ш),
8 = ш/(к + 1 + ш)
ПБЦ-1 0.93 - 0.03 0.04
ПБЦ-2 0.90 - 0.05 0.05
к 1 т ПБЦ-3 0.90 - 0.08 0.02
Га ^ +J ПБЦ-4 0.84 - 0.13 0.03
N Бг- |
(СИ2)2 (СИ2)15 ПБЦ
соо- СИз
а = к/(к + 1 + ш), у = 1/(к + 1 + ш),
8 = ш/(к + 1 + ш)
кислотами, образуют комплексы с полианионами [25] и способны адсорбироваться на отрицательно заряженных липидных мембранах [26]. В настоящей работе кватернизацией поли-4-винил-пиридина ю-бромкарбоновыми кислотами и бромистыми алкилами синтезированы три типа полиамфолитов: с катионными и анионными группами в каждом звене (полибетаины, ПБЕТ), с бетаиновыми и катионными группами (ПБК) и с бетаиновыми группами и боковыми цетильны-ми радикалами (ПБЦ) (таблица). Водные растворы полиамфолитов добавляли к суспензии анионных липосом или в клеточную культуру. В экспериментах с участием липосом контролировали обратимость комплексообразования полимеров с липидной мембраной, целостность мембраны с адсорбированным полимером и ее проницаемость по отношению к малым ионам; в клеточных экспериментах оценивали цитотоксичность синтезированных полиамфолитов. Полученные
результаты важны для понимания механизма взаимодействия синтетических полимеров и биологически активных конструкций на их основе с клеточной мембраной и оценки реакции клеточной мембраны на адсорбированный полимер.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы
Полиамфолиты получали алкилированием по-ли-4-винилпиридина ("АЫйсИ", США) со степенью полимеризации 600 ю-бромкарбоновыми кислотами и бромистыми алкилами в 10%-ном спиртовом растворе, следуя методике, описанной в работе [27]. Полимеры осаждали из реакционной смеси в сухой диэтиловый эфир, осадки промывали эфиром и сушили в вакууме. Степень ал-килирования определяли методом ИК-спектро-скопии на спектрофотометре '^егшо №со1еИ
Ж200" ('^егшо Е1ее1га", США), измеряя соотношение интенсивностей поглощения при 1600 и 1640 см-1 [28] (состав полимеров приведен в таблице). Концентрация полимеров указана в молях кватернизованных (пиридиниевых) групп в литре раствора.
Фосфатидилхолин (яичный лецитин, ЯЛ)
О- К+(СИз)з О=РОСН2СН2
0
Сн2 ,
1 2
СИ-СН2
O=C
I
R
C=O
I
R
дифосфатидилглицерол (кардиолипин, КЛ2 )
NaO i
OH
i
ONa i
O =POCH2CHCH2OP=O
I 2 2 I
O
ch2
ch2—CH
I 2 I
0
1
O
ch2
CH-CH
O=C
I
R
O
C=O R
0
O=C
1
R
2
0
C=O
1
R
и 1,2-диолеоил-глицеро-3-фосфоэтаноламин-М-(карбоксифлуоресцеин, ДОФЭА-КФ)
NH4O
O
O=POCH2CH2NH-C O
I
CH
2
0
o=C
1
R
ch2-ch
I 2 I
O
C-ONH4
O
C=O
R o'
OH
(все производства фирмы "Sigma", США) использовали без дополнительной очистки.
Малые моноламелярные липосомы получали методом озвучивания. Рассчитанные количества спиртовых растворов нейтрального ЯЛ и анионного КЛ2- смешивали и тщательно удаляли органический растворитель на вакуумном роторном испарителе при 50°С. Образовавшуюся тонкую пленку липидов диспергировали в 2 мл буферного раствора. После этого на препарат воздействовали ультразвуком частоты 22 кГц в течение 200 с при 10°С. Использовали УЗ-диспергатор 4710 ("Cole-Parmer", США). Полученные липосомы отделяли от титановой пыли на центрифуге J-11 ("Beckman", Австрия) в течение 5 мин при скорости 104 об/мин. Таким образом были приготовлены липосомы ЯЛ/КЛ2- с мольной долей отрицательно заряженных "головок" КЛ2- v = 0.2. Липо-сомы со встроенной в бислой флуоресцентной
меткой получали добавлением к смеси растворов липидов 0.2 мг ДПФЭ-ФИТЦ (1 мас. % от общего количества липидов). Приготовленные препараты использовали в течение 2 суток.
Суммарная концентрация липидов в полученных образцах 10 мг/мл. Если не оговорено особо, в экспериментах концентрация липидов составляла 1 мг/мл. Размеры липосом, определенные методом квазиупругого светорассеяния, варьировались в пределах 50—70 нм.
Воду очищали двойной перегонкой с последующим пропусканием через систему Milli-Q ("Mil-lipore", США), включающую ионообменные, адсорбционные колонки для глубокой очистки от органических примесей и фильтры для удаления крупных частиц. Очищенная таким образом вода имела удельную электропроводность 0.56 мкСм/см.
Методы
Размер частиц измеряли методом квазиупругого светорассеяния, электрофоретическую подвижность — методом лазерного микроэлектрофореза на приборе "Zetaplus" ("Brookhaven", США). В обоих случаях источником света служил гелий-неоновый лазер с длиной волны падающего света 633 нм. Автокорреляционную функцию флуктуации интенсивности рассеяния света получали с помощью коррелятора К7032-09 ("Brookhaven", США).
Для определения интенсивности флуоресценции растворов использовали спектрофлуориметр F-4000 ("Hitachi", Япония). Концентрацию полибетаинов в растворе оценивали методом УФ-спектроскопии на спектрофотометре "UV-Mini" ("Shimadzu", Япония) по характеристической полосе поглощения пиридинового кольца при X = = 257 нм.
Прикрепляющиеся эпителиоподобные клетки аденокарциномы молочной железы человека линии MCF7 культивировали в стандартных условиях в среде DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), содержавшей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 4 х 10-3 моль/л глютамина, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед/мл пенициллина.
Цитотоксичность полимеров определяли методом прижизненного окрашивания клеток ме-тилтетразолиевым синим (МТТ). Метод основан на прямой корреляции между количеством живых клеток и количеством образующегося из МТТ водонерастворимого формазана [29]. Накануне эксперимента прикрепляющиеся клетки высевали на 96-луночный планшет ("Costar", США) по 3000—4000 клеток в лунку. Из лунок с помощью мембранного насоса (либо автоматического дозатора) удаляли среду культивиров
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.