ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2014, № 6, с. 557-564
= БИОХИМИЯ
УДК 557.152.083.13:579.222.6/.7
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ, КАТАЛИТИЧЕСКИЕ И РЕГУЛЯТОРНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ БАКТЕРИЙ Rhodovulum steppense ШТАММА А-208
© 2014 г. А. Т. Епринцев*, М. И. Фалалеева*, И. В. Парфенова*, М. С. Лященко*,
Е. И. Компанцева**, А. Ю. Третьякова*
*Воронежский государственный университет, 394006Воронеж, Университетская пл., 1 E-mail: bc366@bio.vsu.ru **Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, 117811 Москва, просп. 60-летия Октября, 7, корп. 2 E-mail: elenamaxi@mail.ru Поступила в редакцию 28.07.2013 г.
Проведено исследование физико-химических, регуляторных и кинетических характеристик малат-дегидрогеназы (КФ 1.1.1.37) галоалкалофильных пурпурных несерных бактерий Rhodavulum steppense штамма A-20s. В ходе многостадийной очистки получен в электрофоретически гомогенном состоянии препарат малатдегидрогеназы (МДГ) с удельной активностью 3.775 ± 0.113 Е/мг белка. На гомогенных препаратах определены молекулярная масса фермента, константа Михаэлиса, изучены действие ионов металлов, влияние температуры и термостабильность МДГ Методом Ds-Na-электрофореза выявлено димерное строение фермента.
DOI: 10.7868/S0002332914050038
Аноксигенные фототрофные пурпурные несерные бактерии Rhodоvulum steppense, выделенные из мелководных степных содовых озер Центральной Азии, способны развиваться и функционировать в щелочных условиях при высоких концентрациях солей (соленость 0.3—10%, рН 7.5—10) (Kompantseva et al, 2010). Такие соле-устойчивые организмы обладают особой биологической уникальностью, связанной с разнообразием адаптационных механизмов приспособления к стрессовым воздействиям среды, характеризующейся высоким уровнем солености. Сравнительный анализ геномов и протеомов не-галофильных и галофильных организмов выявляет некоторые общие тенденции у последних, которые выходят за пределы филогенетического родства и геномного GC-содержания. Особый интерес представляют модификации в структуре белков галофилов, которые характеризуются низкой гидрофобностью, преобладающим присутствием кислых остатков, в частности аспартата, и низким содержанием цистеина (Paul et al., 2008).
Важнейший фермент метаболизма — малатде-гидрогеназа (МДГ) (КФ 1.1.1.37) — помимо участия в процессах клеточного дыхания, в цикле трикарбоновых кислот и глиоксилатном цикле способен играть важную роль в компенсации различных метаболических стрессов, возникающих
в экстремальных условиях жизнедеятельности организма. Поэтому МДГ должна обладать повышенной устойчивостью к различным повреждающим факторам, в том числе и к действию ионов.
В литературе приведено много данных о влиянии на состояние МДГ-системы больших концентраций соли, высоких и низких температур, недостатка воды, связей, определяющих компактность упаковки белковой молекулы (Мтапк а1, 2002; Ыт1а г1 а1, 2004; Маёегп, Zaccai, 2004). Структурные перестройки молекулы МДГ — важнейший регуляторный механизм, обеспечивающий адаптивную реакцию к факторам различной природы (Е*зепЪег§, 1995; Е1соск, МсСаттоп, 1998). Ранее в наших исследованиях были установлены особенности структуры МДГ у УыкапШегтш те^о-аНапИет, играющие существенную роль в адаптации клеточного метаболизма к высоким температурам (Епринцев и др., 2005). В связи с этим определенный интерес представляет исследование физико-химических и кинетических характеристик различных форм МДГ, обеспечивающих приспособление к стрессовым условиям на уровне клеточного метаболизма.
Цель работы — проведение комплексного исследования кинетических и регуляторных свойств МДГ из галоалкалофильных пурпурных несерных бактерий Я. steppense штамма А-208,
изучение особенностей структурной организации данной формы фермента и выяснение их важной роли для его функционирования в экстремальных условиях. Необходимость такого исследования продиктована широким распространением бактерий в природе, их способностью адаптироваться к разнообразным условиям существования.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служили фототрофные галоалкалофильные пурпурные несерные бактерии R. steppense штамма A-20s. Для культивирования микроорганизмов использовали питательную среду Пфеннинга следующего состава (на 1 л дистиллированной воды): 0.33 г Na2SO4, 0.33 г KCl, 0.33 г NH4Cl, 0.33 г KH2PO4, 0.33 г MgCl2 ■ 6H2O, 10 г NaCl, 5 г NaHCO3, 0.3 г Na2S ■ 9H2O, 1 г ацетата натрия, 0.1 г дрожжевого экстракта, 1 мл раствора микроэлементов и витаминов — 1 х 10-3 (г/л). Суспензию клеток получали путем центрифугирования культуры при 8000 g и 4°С в течение 10 мин. Клетки отмывали 50 мМ трис-НО-буфером (рН 8.5).
За ферментативную единицу активности МДГ принимали количество фермента, которое превращало (для обратной реакции) или образовывало (для прямой реакции) 1 мкмоль NADH за 1 мин при 25°С. Активность МДГ определяли спектрофотометрически при 340 нм. При определении скорости восстановления оксалоацетата среда спектрофотометрирования содержала 50 мМ трис-HCl (рН 8.5), 1.5 мМ оксалоацетат, 0.15 мМ NADH. Измерение активности МДГ в прямой реакции проводили в реакционной среде следующего состава: 50 мМ трис-НО-буфер (рН 8.5), 4 мМ малат, 1 мМ NAD+. Белок определяли методом Лоури и др. (Lowry et al., 1951).
Очистку фермента осуществляли по модифицированной схеме, включающей в себя получение экстракта фермента, гель-фильтрацию на колонке с сефадексом G-25 (Pharmacia, Швеция), ионообменную хроматографию на колонке с ди-этиламиноэтилцеллюлозой (ДЭАЭ-целлюлозой). Культуры клеток разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора УЗДН-2Т (Россия) при мощности 500 Вт и частоте 22 кГц в течение 2 мин в ледяной бане. Полученный гомогенат обрабатывали сульфатом аммония в конечной концентрации 1.6 М. Осадок отделяли центрифугированием при 4000 g и 4°C в течение 10 мин. Низкомолекулярную фракцию супернатанта отделяли на колонке (1.5 х 10 см) с сефадексом G-25. Объем наносимого образца не превышал 4 мл. После нанесения пробы колонку заполняли буферным раствором (50 мМ трис-НО-буфер, рН 8.5) и начинали элюирование. Ионообменную хромато-
графию проводили на колонке (1.5 х 12 см) с ДЭАЭ-целлюлозой (Whatman, Англия). Элюцию осуществляли ступенчатым градиентом KCl 260— 280 мМ в 50 мМ трис-На-буфере, рН 8. Собирали фракции по 2 мл и определяли в них активность фермента. На заключительной стадии использовали гель-хроматографию на колонке (2 х 40 см) с сефадексом G-200 (сверхтонкий) (Pharmacia). Элюцию проводили 50 мМ трис-НО-буфером (рН 8.5). Колонки предварительно уравновешивали 50 мМ трис-НО-буфером. Все стадии проводили при 0—4°С.
Молекулярную массу нативного фермента определяли гель-хроматографией на колонке (2 х х 40 см) с сефадексом G-200, молекулярную массу субъединиц — методом электрофореза в присутствии Ds-Na при концентрации полиакрила-мидного геля (ПААГ) 12.5%. Для построения калибровочной кривой использовали маркерные белки (кДа): фосфорилазу В-97, БСА-66.2, яичный альбумин-45, карбоангидразу-31, трипсин-21.5, лизоцим-14.4.
Электрофорез нативной МДГ проводили методом Девиса (концентрация ПААГ 8%) (Davis, 1964). Для специфического проявления применяли тетразолиевый метод, для универсального проявления на белок — методику с нитратом серебра (Shevchenko et al., 1996).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты типичной очистки МДГ из R. steppense штамма А-20s приведены в табл. 1. Применение многостадийной очистки позволило получить ферментный препарат МДГ из исследуемых бактерий, культивируемых в фотоорганотрофных условиях, с удельной активностью 3.775 ± ± 0.113 Е/мг белка (степень очистки 92 раза). Особенностью очистки МДГ из R. steppense было предварительное осаждение балластного белка добавлением 1.6 М сульфата аммония. Важнейшей стадией в схеме очистки была ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе, после проведения которой МДГ из исследуемых микроорганизмов была получена в гомогенном состоянии. Элюция фермента наблюдалась при более высоком значении градиента KCl (260—280 мМ), чем при изучении МДГ, выделенной из других объектов. Такие особенности очистки, вероятно, были связаны со специфическими адаптационными модификациями белков солеустойчивых бактерий, характеризующихся высоким содержанием дикарбоновых аминокислот (Elcock, McCammon, 1998). Для поддержания их структуры необходимы высокие концентрации Na+ и К+, нейтрализующих ионизированные карбоксильные группы аминокислот.
Таблица 1. Очистка МДГ из Rhodovulum steppense штамма A-20s
Стадия очистки Общий объем, мл Общая активность, мкм/ мин Белок, мг Удельная активность, мкм/мг белка мин Степень очистки Выход, %
Гомогенат 6.5 13.91 338.4 0.041 1 100
Супернатант 5 9.73 215.7 0.045 1.1 70
Гель-фильтрация через сефадекс 0-25 6 8.17 78 0.105 2.5 58
Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе 6 6.42 5.13 1.251 30.5 46
Гель-хроматография на сефадексе 0-200 1 2.78 0.74 3.775 92 20
Примечание. Число биологических повторностей — 3, р < 0.05.
В литературе имеются данные, аналогичные полученным в наших экспериментах. Так, значение удельной активности МДГ из пурпурного фо-тотрофного микроорганизма Rhodospirillum rubrum составило 2.33, а из бактерий Rhodopseudomonas palustris — 4.88 Е/мг (Климова, 2006).
Удельная активность для МДГ из V. medioatlan-ticus равна 6.94, а из бактерий Leucothrix mucor — 1.194 Е/мг белка (Парфенова, 2004).
Электрофоретический анализ очищенного препарата в ПААГ при универсальном окрашива-
(а) (б)
F
нии на белки и специфическом проявлении на МДГ-активность показал одну полосу с Rf = 0.53 (рис. 1).
Получение высокоочищенных препаратов МДГ позволило изучить физико-химические и кинетические свойства фермента из исследуемых объектов (табл. 2). Определенная гель-хроматографией на сефадексе 0-200 молекулярная масса нативной МДГ из R. steppense, культивируемых фотоорганотрофно, составила 102 ± 2.4 кДа.
\ . \ # I
щ янвд
1
2
U JEBL
4
5
6
Рис. 1. Электрофореграмма МДГ из Rhodovulum steppense. а — специфическое проявление, б — окрашивание нитратом серебра, F — фронт красителя бромфе-нолового синего.
Рис. 2. В8-Ма-электрофорез
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.