БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 5, с. 883-888
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =
УДК: 577.323.23
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КОМПЛЕКСОВ ГИСТОНА Н2А И МОДИФИЦИР ОВАННОГО ГИ СТОНА Н2А-ТАТ
С ПЛАЗМИДНОЙ ДНК
© 2015 г. А.В. Введенский* **, С.В. Сизова*, А.И. Кузьмич* ***
*Институт биоорганической химии им. академиковМ.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; **Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,
119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, 1/12; ***Институт молекулярной генетики РАН, 123182, Москва, пл. А кадемика И.В. Курчатова, 2
E-mail: Vvedenskiia@gmail.сот Поступила в p едакцию 16.04.15 г.
Гистон Н2А способен доставлять трансгенную ДНК в клетки млекопитающих в условиях in vitro. Способность доставлять ДНК в условиях in vivo еще предстоит оценить, но в экспериментах in vitro можно определить факторы, способные определять эффективность доставки in vivo. Первый шаг в этом направлении - определение размеров и Z-потенциалов комплексов Н2А с ДНК. В данной работе были получены рекомбинантный гистон H2A и его модификация, содержащая пептид белка TAT вируса иммунодефицита человека (TAT-пептид), способный обеспечивать усиление доставки макромолекул в клетки млекопитающих. В работе измерены эффективные диаметры и Z-потенциалы частиц, образующихся при смешивании гистона Н2А с ДНК, и исследовано влияние ТАТ-пептида на эти параметры. Комплексы с гистоном Н 2А и комплексы с модифицированным гистоном Н 2А-ТАТ обладали положительным Z-потенциалом. Комплексы гистона Н 2А с ДНК имели эффективный диаметр около 200 нм, модификация гистона ТАТ-пептидом приводила к агрегации комплексов и формированию крупных частиц диаметром около 1 мкм.
Ключевые слова: комплексы гистон—ДНК, гистон Н2А, размер частиц, Z-потенциал частиц, конденсация ДНК, ТА Т-пептид.
Генная терапия - метод лечения заболеваний различной этиологии при помощи доставки в клетки нуклеиновых кислот. В случае доставки ДНК терапевтический эффект оказывают продукты экспрессии трансгенов. Стратегии, о снованные на генной терапии, являются одними из наиболее перспективных подходов для лечения многих типов наследственных заболеваний и различных типов неоплазий [1,2]. В качестве векторов доставки ДНК в клетки в о с-новном используются вирусные системы. Однако векторы на основе вирусов часто обладают ограниченной эффективностью, связанной с развитием иммунного ответа на вирусный носитель [3,4], а их использование в редких случаях может приводить к летальному исхо-
ду [5].
В связи с этим возникает необходимость в разработке новых неиммуногенных и эффективных носителей ДНК. Некоторые исследователи считают, что векторы на основе гистонов имеют широкие перспективы применения т
vitro и in vivo [6,7]. Описано, что данные белки и их производные могут обеспечивать транс-фекцию in vitro на высоком уровне [8-10]. В нашей лаборатории также было показано, что гистон Н 2А обладает трансфекционной активностью в условиях in vitro (данные не опубликованы). В ряде работ исследователи достигали увеличения трансфекционной активности за счет пр исоединения к комплексам с ДНК ТАТ-пептида (YGRKKRRQRRR) из группы CPP (CPP рерйёе - сокращение от се11 реие1;га1е<1 рерйёе) [11-14]. В нашей лаборатории также исследовалось влияние присоединения ТАТ-пептида к гистону Н 2А на эффективность транс-фекции in vitro (данные не опубликованы).
Вместе с тем высокого уровня трансфекции in vitro недостаточно для эффективной работы трансфекционных агентов в условиях in vivo. П ри системном введении в о рганизм большое значение имеет размер и Z-потенциал частиц (величина Z-потенциала отражает плотность заряда на поверхности частицы), образующихся
883
4*
при конденсации ДНК трансфекционным агентом. К рупные частицы размер ом 300 нм и более при введении в кровяное русло быстро выводятся из кровотока ретикулоэндотелиальной системой печени, хотя скорость захвата также зависит от со става частиц [15,16]. К р оме того, способность крупных частиц проникать сквозь стенки сосудов сильно огр аничена. Так, в случае доставки в опухоли было показано, что частицы размером более 600 нм практически не проникают в опухолевые ткани из кровотока [17]. Возможное влияние величины Z-потенциала на трансфекцию in vivo не столь однозначно. C одной стороны, частицы с отрицательным Z-по-тенциалом медленнее выводятся из кровотока [15,18]. C другой стороны, на пример е катион-ных липосом было показано, что для высокого уровня трансфекции необходим положительный заряд на поверхности тр ансфицирующих частиц [19]. Таким образом, можно сделать вывод, что частицы с диаметр ом 100-200 нм и небольшим положительным значением Z-потенциала, при условии высокой трансфекционной активности, могут быть использованы в системах in vivo.
Целью нашей работы стало изучение размер ов и Z-потенциалов комплексов, образующихся пр и конденсации ДНК гистоном Н 2А и модифицир ованным гистоном Н 2А-ТАТ. Измерения проводили методом динамического светорассеяния. На основании полученных данных сделан прогноз перспектив использования исследованных носителей для доставки ДНК в условиях in vivo.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Получение и очистка плазмидной ДНК.
Плазмидную ДНК рСМУ-рвЬЗ (Clontedi, США) нарабатывали в штамме DH5a E. coli, выделение и очистку проводили с помощью набора Nudeobond PC 100 (Maderey-Nagel, Гер мания) в соответствии с рекомендациями производителя. Препарат плазмиды ресуспен-дировали в фосфатно-солевом буфере и хранили при температуре -20°C. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически по поглощению при 260 нм, чистоту препарата определяли по соотношению абсорбции (А ^А 280), а также при помощи электрофореза в 1% агароз-ном геле.
Клонирование, экспрессия и очистка реком-бинантных гистонов. Экспрессионный бактериальный вектор рЕТ30а(+) (Novagen, CША), несущий кодир ующую последовательность гисто-на Н 2А человека, был любезно предо ставлен М.В. Зиновьевой. Последовательность, кодирующую ТАТ-пептид, вносили при помощи
ПЦР c праймерами, один из которых содержал последовательность, кодирующую ТАТ-пептид. Полученный ПЦР-продукт клонировали в вектор рЕТ30а(+). Последовательность полученных конструкций была подтверждена секвени-рованием. Генетическими конструкциями трансформировали экспр ессионный штамм E. coli BL21. Трансформированные колонии выращивали в ср еде LB с 30 мкг/мл канамицина. Cинтез белков индуцировали добавлением 1 мМ IPTG с последующей инкубацией в течение 3 ч при 37°C при постоянном встряхивании. Клеточную культуру центр ифугировали, клетки бактерий ресуспендировали в лизирую-щем буфере (50 мМ трис-HCl, рН 8,0, 5мМ ЭДТА), после чего разрушали пр и помощи ультразвука. Лизат осветляли центр ифугирова-нием (16000 g в течение 35 мин).
Полученный супернатант наносили на колонку со смолой SP Sepharase high регЮгшапсе (GE Неа1Шсаге, Великоб ритания). Элюцию про -водили в 50 мМ трис-НС1-буфере, рН 8,0, в градиенте NaC1 от 0 до 1 М. Далее фр акцию, содержащую целевой белок, наносили на колонку BIO Wide Роге С18 (Supe1co, Япония) для проведения HPLC. Гистон элюировали в 0,1% трифтор уксусной кислоте в градиенте аце-тонитрила от 20 до 80%. Затем пр оводили высушивание препарата в вакуумной центрифуге SpeedVac Concentгatoг (Savant, CША). Полученный сухой остаток растворяли в фосфатно-солевом буфере (Life Tecno1ogies, CША).
Модифицированный гистон Н 2А-ТАТ со -держал последовательность ТАТ-пептида на C-конце. При выделении модифицированного гистона Н 2А-ТАТ к полученному после разрушения клеток осветленному супернатанту добавляли р аствор HC1 до конечной концентрации 0,4 М, центрифугировали при 4000 g 35 мин. Cупеp натант доводили до рН 4,5, после чего наносили на колонку со смолой Toyopeaг1 SP-650M (Tosoh, Япония). Элюцию пр оводили в 300 мМ Na-ацетатном буфере с рН 5,5 в градиенте NaC1 от 0 до 1 М. Далее фракцию с модифицированным гистоном Н 2А-ТАТ очищали пр и помощи HPLC и концентрировали в вакуумной центрифуге в условиях, аналогичных для гистона Н 2А. Cуxой препарат растворяли в фосфатно-солевом буфере.
Концентрацию белков определяли по методу Бредфорда и спектрофотометрически с использованием величины молярного коэффициента экстинкции для гистона Н 2А и Н 2А-ТАТ -3840 л-моль_1-см_1 (https://www.neb.com/pгoducts/ m2502-histone-h2a-human-гecombinant). Чистоту препаратов определяли при помощи денатурирующего гель-электрофореза в 15% полиакри-
ФИЗИКО-ХИМИЧЕС КИЕ СВОЙ C ТВА КОМПЛЕКСОВ ГИ СТОНА
885
от(гистона): «(ДНК) то(гистона): от(ДНК)
Рис. 1. Связывание молекул гистонов с ДНК. 20 мкг ДНК в 2 мл фосфатно-солевого буфера смешивали с гистонами (использовали соотношения ДНК:гистон по массе 1:0,125; 1:0,25; 1:0,5; 1:0,75; 1:1; 1,25; 1:1,5; 1:1,75). (а) - Зависимости светорассеяния раствора плазмидной ДНК от концентрации гистонов. По результатам измерений построены зависимости согласно уравнению Больцмана для сигмовидной кривой. Серым цветом показана кривая светорассеяния для модифицированного гистона Н2А-ТАТ, черным цветом - для гистона Н2А. (б) - Зависимости эффективных диаметров комплексов от концентрации гистона.
ламидном геле с последующей окраской гелей красителем Кумасси.
Приготовление комплексов гистонов c ДНК.
Комплексы гистонов с плазмидной ДНК готовили в фосфатно-солевом буфере следующим обр азом: в пр обу суммарным объемом 2 мл добавляли ДНК до конечной концентрации 10 мкг/мл (Ср, концентр ация фосфатных групп - 30 мкМ), затем добавляли различные количества гистона (диапазон конечных концентраций составлял от 1,25 до 500 мкг/мл). Пробу тщательно перемешивали и инкубиро-вали 30 мин при комнатной температуре, далее производили измерения.
Измерение эффективного диаметра и Z-по-тенциала комплексов. Измерения эффективного диаметра проводили методом динамического светорассеяния на приборе БгоокЬауеп 90р1и рагйс1е size ana1yzer (БгоокЬауеп, США), температура измерения 25°С, 10 циклов, продолжительность каждого цикла 1 мин. П ри помощи прогр аммного обеспечения 90P1us Partic1e sizing 8ойжаге, предоставленного производителем оборудования, вычисляли эффективный д
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.