БИОФИЗИКА, 2009, том 54, вып. 6, с. 1045-1050
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 548.535.
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ АНТИ СЕПТИЧЕСКОГО ДЕЙ СТВИЯ НАНОГИДР ОКСИАПАТИТА
© 2009 г. А.В. Северин, С.Е. Мазина, И .В. Мелих ов
Xимический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,
119992, Москва, Воробьевы горы
E-mail: severin@radio.сНвт.msu.ru
Поступила в p едакцию 01.12.08 г.
Исследован механизм взаимодействия нанокристаллов гидроксиапатита с бактериями Staphy-1ососсш aureus. Показано, что ро ст бактер ий и и х колоний, как в пр и сут ствии гидр оксиапатита, так и в его отсут ствие, может быть описан с использованием ур авнения типа Фоккер а-Планка. Установлено, что нанокр исталлы гидр оксиапатита о р иентир ованно адгезир уют ся на поверхности бактер ий, существенно снижая их способность к обр азованию колоний.
Ключевые слова: гидроксиапатит, антисептическое действие, бактерии Staphylom^us aureus.
Гидр оксиапатит (ГАП) является стимулятор ом р о ста костной ткани [1] и пр оявляет антисептические свойства [2]. Нанокр исталлы ГАП, цир кулир уя в к р овотоке, накапливаются в местах образования тромбов и «камней» [3,4]. Поэтому пр облема взаимодействия кр исталлов наногидроксиапатита с клетками и тканями пр едставляется актуальной, о собенно в связи с р азвитием медицинских нанотехнологий. P еше-нию этой проблемы посвящено много работ, в которых, в частности, показано, что действие ГАП на клетки зависит от размера, формы кр исталлов и степени их ср астания в агломераты [5,6]. В данной работе получена новая информация о механизме действия кристаллов ГАП на бактерии Staphylococcus aureus и, в ча стности, на их р епр одуктивную способность.
стояниям, котор ая в континуальном пр иближе-нии удовлетво р яет условию:
N = J ф(__ )d__
где N - число бактерий в единице объема ср еды, а х{ - пр о стр анственные координаты, скор о сть движения, масса, р азмер ы, физиоло -гическая активность бактер ии и т. д.
Функция tyi(xft) изменяется в пр оцессе ро ста бактер ий и их делений, такой ро ст пр оисходит с флуктуациями из-за колебаний свойств ср еды и случайных отклонений в функционировании клеток [7]. Если допустить, что бактер ии делятся пополам по сле достижения со стояния
4, то
ПОС ТАНОВКА ЗАДАЧИ
Реакция бактер ий на ГАП не может не зависеть от того, находятся они в си стеме как индивидуальные особи или входят в состав колоний. Поэтому необходимо исследовать отклик на присутствие ГАП как отдельных бактериальных клеток в суспензии, так и их колоний на питательном суб стр ате.
Состояние каждой индивидуальной бакте-
р ии
x
ха р актер изует
р яд
параметров
lH= div(GB9"^BV(P)+ швФ _ (1)
_ -
1 m _^
где GB - скор о сть напр авленного изменения x;
Зв _ тензор флуктуаций х; Уф - градиент ср; ы^/Г) - удельная частота делений бактерии, находящихся в состоянии л с появлением бактерий в состоянии хс\, шв = | ш(л^лЛ)^л"л.
Если в систему введены кристаллы ГАП, то они могут переходить на поверхность бак-тер ий и взаимодействовать с компонентами клеточной мембр аны (контактное взаимодействие). Кр оме того, кр исталлы ГАП спо собны со р би-р овать компоненты ср еды, необходимые для жизнедеятельно сти бактер ий, а также р аство-
{x 1..xi..x m}, а со стояние суспензии в целом -функция ф ¡(_t) распр еделения бактер ий по со -
C окр ащение: ГАП - гидр оксиапатит.
ряться, изменяя ее со став (бесконтактное взаимодействие). В результате этого
сН|/ 'dt'
:div(GH\|/-i>HV\|/) + 0v|/
(2)
пр и
C = J y(yft)dyf Q = J q(yfSф(у)dxf
= УобЙ
где ^(уЬ) - функция ра спр еделения кр и сталлов по свойствам у* = {у1 ... yS}, включая массу, координаты центр а масс, пар аметр ы габитуса и т .д.; GH - скор о сть напр авленного изменения
параметров состояния кристаллов вследствие растворения или сорбции; Зя - коэффициент флуктуации у* С - концентрация кристаллов ГАП; q(уf - поток кр и сталлов со свойствами уна поверхно сть бактер ии площадью S.
Ур авнение (1) пр именимо для колоний, если каждую бактер ию колонии хар актер изовать не только пар аметр ами, пер ечи сленными выше, но и р асстоянием до со седних бактер ий и хар актер ом взаимных контактов с соседними клетками. Однако такое описание на основании имеющего ся экспер иментального матер иала не представляется необходимым, так что можно р а ссматр ивать каждую колонию как тело с ха -рактеристиками у = {z 1 ... zrl}, а множество колоний характеризовать функцией распределения f((у, t), удовлетво р яющей условиям:
где М - число колоний на единице площади поверхности субстрата; ЩиВ^- скорость изменения г^и коэффициент ее флуктуации.
Из изложенного следует, что изучение взаимодействия ГАП с бактериями целесообразно пр оводить поэтапно. На первом этапе необхо -димо получить пр иближенное пр едставление о пр оцессе, описывая со стояние индивидуальной бактер ии только ее р азмер ом x, считая в се о стальные пар аметры функционально связанными с x. В данном однопа р аметр ическом пр и-ближении (**= x) ур авнение (1) пр инимает вид:
Эф d
dt dx
Овф - D в
дф
dx
(4)
где GB - скор о сть изменения размер а бактер ии, измер яемого пр и наблюдении в микр о скоп; D в -коэффициент флуктуации этого р азмер а.
Аналогично, если каждую колонию ха р актер изовать только размер ом Z ее пр оекции на поверхность суб стр ата, то:
df = э_
dt dz
Gf - D
l f dz
(5)
С опоставление опытных данны х о функциях ф(х,0 и f(z,t) с уравнениями (4) и (5) позволит р ешить, пр именимо ли однопар аметрическое континуальное приближение для описания взаимодействия бактер ий и ГАП, а п р и положительном решении - определить функции
GB = GBqвв(С,х), Gf = GfPf(C,z), © = ©P© (C),
где GB и Gf - скор о сти изменения р азмер а
о о
бактер ии и колонии в отсутствие ГАП; ©0 -частота деления без ГАП; PB(C,x), Pf(C,z) и P©(C) - факторы влияния ГАП.
На втор ом и по следующих этапах целесо -обр азно р а сшир ять множества у и у^хар актер изуя каждую бактерию не только р азмер ом, но и фо р мой, пар аметр ами со стояния клеточной мембраны, а каждую колонию - характер истиками укладки бактер ий в ее объеме и т.д. Это приведет к последовательному приближению к определению факторов
PB(C,yy,Pf(C,y? и (3JC),
которые являются целью исследования. В данной статье пр ед ставлены некото р ые результаты пер вого этапа выполнения указанной пр огр ам-мы, а именно результаты выявления возможно стей однопараметрического описания взаимодействия бактер ий с ГАП в континуальном пр иближении. П р и этом решался вопр о с о том, как связано антисептическое действие ГАП с огранкой его кристаллов. Как известно, ГАП может быть получен в форме иглообразных нанопластин, боковая поверхно сть котор ы х является высокоактивной. П р и пр огр еве кр исталлов боковые грани упорядочиваются, теряя свою активность, что проявлялось, в частности, в увеличении энер гии связи молекуляр ных о р-биталей на 0,5-0,7 эВ (по данным рентгено-электр онной спектр о скопии) [8]. В пр едставлен-ной работе решали вопр о с о роли вышеупомянутого пр оцесса в изменении антисептической активности ГАП.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культур ы бактер ий Staphylococcus aureus выращивали на среде МПА по стандартной методике в течение 24 ч [9] с по следующим пе-
ФИЗИКО-ХИМИЧЕС КИЕ АС ПЕКТЫ АНТИ СЕПТИЧЕСКОГО ДЕЙ С ТВИЯ 1047
Р ис. 1. Интегр альное р аспр еделение нанокр исталлов ГАП по длине (а) и ширине (б) по размеру: 1 - ГАП-I; 2 - ГАП-II; 3 - плотные образования у бактер ий Staphylococcus aureus.
Р ис. 2. Распр еделение бактер ий по р азмер ам. C плошная кр ивая - р езультаты ра счета по фо р муле (6).
толщиной 4 мм [9]. П р и этом пр оба ра стекалась по поверхности геля (субстрата) с образованием р авномер ного слоя толщиной 0,1 мм. Со суд с субстратом герметизировали и выдерживали пр и 310 К в течение вр емени 12 = 7,9-104 с, за котор ое бактер ии фо р мир овали колонии на поверхности субстрата. Поверхность субстрата фотографировали и определяли функцию ¡(г, 12).
р ено сом в изотонический ра створ. Водную суспензию высокоактивного гидроксиапатита (ГАП-I) готовили по методике [10]. Часть этой суспензии кипятили в течение 2 ч с целью получения гидроксиапатита с пониженной активностью кр и сталлов (ГАП -II). П р и пр оведе-нии каждого опыта определенный объем суспензии ГАП смешивали с суспензией бактер ий и смесь перемешивали в течение 3 мин при неизменных условиях. При этом объем смеси поддер живали равным: V = 20 см3, темпер атур у Т = 310 ± 0,5 К, рН 7,1, концентрацию МаС1 -С н = 1,5-10-4 моль/дм3 (изотонический ра створ). И сходная концентр ация бактер ий была р авна: N0 = 300 кл/мл, а исходная концентр ация частиц ГАП составляла: С0 = 1,7-1013 см-3.
Из смеси отбирали пробы, которые обрабатывали по методике [11]. Препараты исследовали в трансмиссионном электронном микро скопе (ШОЬ ШМ-100В, Япония) и опр еделяли функции ф(х, 0_р аспр еделения бактер ий по р азмер ам: х = ЧИТп, где ^ - площадь изо-бр ажения бактер ии в микр о скопе, и функции
х, t), 2, t) р а спр еделения к р и сталлов по длине у 1 и шир ине у 2.
В момент в р емени 11 = 180 с по р цию смеси переносили на чашки Петри, дно которых было покр ыто гелевым слоем мясопептонного агар а
Р ЕЗУЛЬТАТЫ
Кр исталлы суспензии ГАП имели фо рму удлиненных пластин, распределение которых по длине у х и шир ине у 2 пр иведено на рис. 1. Торцевая и боковая поверхности кристаллов ГАП -I имели множество ступеней высотой 1-3 нм. Боковую поверхность ГАП-II составляли плоские нанограни.
Бактер ии в суспензии имели фо р му, пр и-ближенную к элипсоиду вр ащения, пр ичем отношение длин о сей элипсоидов не было постоянным. Интегр альное р аспр еделение бактер ий по размеру (рис. 2) описывали формулой:
^ Г
F(x ,t 1) = — |ф(М 1)dx = 1 - ехр1 -к
п L
x - x 0
31 (6)
I
где х 0 = 0,63 ± 0,02 мкм, х т = 1,26 ± 0,03 мкм, к = 0,83 ±0,1 - эмпирический параметр.
В момент в р емени 11 большинство кр истал-лов суспензии было собрано в неупорядоченные флоккулы, а бактер ии не обр азовывали крупных агрегатов, но находились в объеме флоккул. На поверхно сти бактер ий фор мир овались группы адгезированных кристаллов (рис. 3). Р
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.