БИОФИЗИКА, 2009, том 54, вып.5, c.773-790
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА
УДК 577.3
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ, СВЯЗЫВАЮЩИХСЯ С Р НК-ПОЛИМЕРАЗОЙ, НО НЕ СВЯЗЫВАЮЩИ ХСЯ С ДНК
© 2009 г. Е.В. Степанова*, А.Б. Шевелёв**, С.И. Борухов***, К.В. Северинов* **** *****
*Институт биологии гена РАН, 119334, Москва, ул. Вавилова, 34/5;
**
Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, 142782, Московская область, Ленинский район;
***Department of Cell Biology, University of Medidne and Dentistry New Jersey, 08084, USA, NJ, Stratford,
2 Medial Center Drive;
****Department of Modular Biology and Bio^emistry, Waksman Institute of Mkrobiology, Rutgers, The State University of New Jersey, 08854, USA, NJ, Piscataway, 190 Frelinghuysen Road;
E-mail: severik@waksman.rutgers.edu *****Институт молекулярной генетики РАН, 123182, Москва, пл. Академика И.В. Курчатова, 2
Поступила в p едакцию 11.08.09 г.
Изучение механизмов pегуляции экспрессии генов - одна из самых бурно pазвивающихся областей молекуляр ной биологии и генетики. РНК-полимер аза - ключевой фермент пер вого этапа экспрессии генов - тр анскр ипции ДНК. В данном обзоре рассмотрены транскр ипционные фактор ы, котор ые не связываются с ДНК непоср едственно. Они связываются с РНК-полимер азой, пр о ходят чер ез канал фермента, достигая каталитического центр а, и это взаимодействие модулирует активность каталитического центр а фермента. К настоящему моменту, известно шесть прокариотических факторов этой группы: GreA, GreB, Gfhl, Rnk, DksA и TraR, а также их эукариотический аналог TFIIS. Факторы GreA, GreB и TFIIS стимулируют реакцию р асщепления тр анскр ипта РНК-полимеразой. Т р анскрипт-расщепляющая активность способствует пр о хождению тр анскр ипционных пауз и участков перманетной о становки РНК-поли-меразы. За последние 15 лет накопился большой объем информации о структуре, функции и механизмах действия тр анскр ипт-расщепляющих факторов. Эти данные, а также сведения о других белках-регуляторах, рассмотрены в настоящем обзоре.
Ключевые слова: РНК-полимераза, вторичный канал РНК-полимеразы, транскрипт-расщепляющая активность, транскрипционные паузы и остановки траснкрипции.
В настоящее время интенсивно изучаются механизмы регуляции транскрипции, основанные на модуляции каталитической активности РНК-полимеразы (РНКП). Большой интерес вызывают молекулярные механизмы действия факторов, связывающихся во вторичном канале РНКП (р ис. 1). Число известных факторов этой группы постоянно растет. К ним относятся как гомологичные, так и неродственные белки со сходной пространственной организацией, которая приспособлена для связывания с ферментом. К настоящему моменту известны следующие факторы этого класса: транскрипт-р асще-пляющие факторы семейства вге [1,2], обнару-
Сокращения: РНКП - РНК-полимераза, ЭК - элонгаци-онный комплекс, Tth - Thermus thermophilus, ПЗУ - положительно заряженный участок.
женные почти во всех эубактериях; ингибитор транскрипции 01Ь1 [3], обнаруженный в микроорганизмах группы Оетососсш-ТНвгтш; глобальный регулятор системы строгого контроля Бк^А [4,5], осуществляющий регуляцию кооперативно с алармоном ррврр; недавно откр ытый глобальный регулятор ТгаИ [6], последовательность которого кодируется на ДНК конъюга-тивных плазмид широкого круга хозяев, а также фактор Иик [7].
Несмотря на обилие имеющейся информации, представления о факторах, действующих через вторичный канал, все еще остаются неполными: для некоторых из них отсутствуют стр уктурные данные (ТгаИ), для других остается невыясненным механизм связывания и р егуляции активности РНКП (Бк8А, ТгаИ, Иик), для третьих - не до конца установлена их биоло-
Рис. 1. Элонгационный комплекс РНКП. На рисунке схематически показано устройство ЭК, вид со стороны первичного канала. В полости первичного канала РНКП располагается каталитический центр (консервативный мотив КЛБББОБ изображен тонкой линией, его аминокислоты хелатируют ионы I и II, изобра-
женные серыми сферами), транскрипционный пузырь и ДНК-РНК-гетеродуплекс, в котором РНК изображена жирной прерывистой черной линией. Вблизи от каталитического центра открывается воронка вторичного канала (изображен как желоб серого цвета), которая отделена от первичного канала элементами Р'Б-мост и Р'О-петля. Передний ДНК-дуплекс связывается элементом РНКП передний ДНК-связывающей зажим. Матричная цепь ДНК изображена черной жирной линией, нематричная цепь ДНК - серой. В задней части фермента расположен канал выхода РНК. В канале выхода РНК располагается выходящий наружу одноцепочечный РНК-продукт.
гическая роль в клетке (вгеЛ, вгеБ, в&1, Иик). Очевидно, однако, что регуляция транскрипции через вторичный канал РНКП - это один из важных, эволюционно консервативных механизмов клеточной регуляции.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ ОБ РНК-ПОЛИМЕРАЗАХ П РОКАРИОТ
ДНК-зависимая РНК-полимераза - главный фермент транскрипции в клетке, который ответственен за синтез цепи РНК, комплементарной транскрибируемой цепи ДНК-матрицы, в присутствии субстратов - рибонуклеозид-5'-тр ифосфатов (рНТФ). Мультисубъединичные РНКП эукариот, архебактерий и эубактерий гомологичны друг другу [8]. Каталитически активный кор-фермент РНКП большинства эу-бактер ий со стоит из 5 ^РР'ю) субъединиц: двух а (~36 кДа), в (~ 150 кДа), в' (~ 155 кДа)
и ю (~8,5 кДа) и имеет общий молекулярный вес ~380 кДа. Для специфической инициации транскрипции с определенной позиции ДНК-матрицы кор-фермент должен связаться с одним из фактор ов специфичности а (или а-субъеди-ницей, ~20-70 кДа) с образованием холофер-мента РНКП (а2вв'юа) [8-12].
Структуру РНКП можно описать как глобулу эллипсоидальной формы с глубоким вырезом посередине молекулы, что придает ей сходство с клешней краба. Основанием «клешни» является димер а-субъединиц, взаимодействующие с ним уча стки в и в' и каталитический центр. Основная белковая масса в- и в'- субъединиц образует своеобразные «зажимы», полость между которыми служит для связывания ДНК-матрицы и РНК-продукта. Удобно выделить передний и задний края фермента, взяв за основу направление движения РНКП вдоль мо-
лекулы ДНК. Соответственно, ДНК-дуплекс, входящий в полость фермента, будет называться передним, а выходящий - задним (рис. 1). Передняя часть полости разделена перегородкой на два канала: большой первичный и малый вторичный каналы [8-12].
Первичный канал (рис. 1) служит для связывания входящего ДНК-дуплекса (длиной ~ 15-20 пн), тр анскрипционного пузыр я (уча стка ДНК длиной 12-14 пн, где происходит плавление ДНК-дуплекса) и ДНК-РНК-гетеродуп-лекса (длиной в 9 ± 1 нт) (рис. 1) [13]. Для предотвращения схлопывания транскрипцион-но го пузыр я нематричная цепь удер живается элементами зажима ß, а матричная цепь ДНК направляется элементами субъединицы ß' к каталитическому центру. Каталитический центр РНКП встроен в стенку первичного канала. Он образован консервативным мотивом ß'-субъе-диницы NADFDGD. Тр и остатка Л8р этого мотива (у E. coli - Л8р739, Л8р741 и Л8р743) хелатируют первый ион Mg2+ I, необходимый для катализа. Эти остатки вместе с кислыми остатками ß-субъединицы (у E. coli - Glu685 и Л8р686) также участвуют в хелатировании второго каталитического иона Mg2+ II [9,11,13]. ДНК-РНК-гетеродуплекс берет свое начало от каталитического центра и, проходя по стенке первичного канала, заканчивается в задней части фермента на перегородке, разделяющей ДНК и РНК. Выходя из ДНК-РНК-гетеродуплекса, 5'-концевой одноцепочечный участок транскрипта (длиной в ~6 нт) поступает в канал выхода РНК. После разделения РНК-ДНК-ге-теродуплекса верхняя часть матричной цепи ДНК восстанавливает дуплекс с нематричной цепью ДНК и свободно покидает пер вичный канал, не вступая в дальнейшее взаимодействие с РНКП [9,13].
Вторичный канал имеет форму воронки (р ис. 1). Широкое отверстие вор онки открывается на передней поверхности РНКП. Постепенно сужаясь, втор ичный канал пр оходит внутрь фермента, и его малое отверстие откр ы-вается рядом с каталитическим центр ом. В нижней части полость вторичного канала отделена от первичного канала перегородкой, состоящей из элементов ß'F-мост и ß'G-петля [9,13]. Через втор ичный канал в каталитический центр поступают суб страты, и происходит диссоциация 3'-концевого фрагмента РНК в обр атносмещен-ных комплексах (см. ниже). Вторичный канал также служит сайтом связывания тр анскрипци-онных факторов, рассмотренны х в данном обзоре.
Транскр ипция представляет собой циклический процесс, который можно разделить на три стадии: связывание РНКП промоторной ДНК и инициация синтеза РНК; пр оцессивная элонгация цепи РНК; и терминация синтеза и диссоциация конечного пр одукта (полноразмерного РНК-транскрипта).
РНКП начинает новый транскрипционный цикл в виде холофермента, включающего а-субъединицу [9,14,15]. С ее помощью происходит узнавание и связывание промоторной последовательности ДНК. Для узнавания некоторых промоторов также необходимо участие а-субъединицы [16,17]. После плавления ДНК-дуплекса в районе точки старта транскрипции и формирования транскрипционного пузыря начинается синтез РНК. Перед тем, как РНКП начнет процессивную элонгацию, фермент проходит стадию первичного, так называемого абортивного, синтеза транскрипта [9,18].
На начальной стадии абортивного синтеза транскрипта кор-фермент сохраняет контакты с а-субъединицей, а а-субъединица - с промоторной последовательностью ДНК. В ходе синтеза, двигаясь вперед относительно матрицы, РНКП, по-видимому, втягивает транскрибируемый участок двухцепочечной ДНК внутрь, а расплетенные одноцепочечные участки, вероятно, выпетливаются наружу. Этот процесс, так называемое сжатие (8сгипсЫп§), должен сопровождаться внутренней деформацией фермента и ДНК-матрицы [19]. Накапливающееся по мер е синтеза РНК упругое напряжение в инициатор-ном комплексе может являться источником энергии либо для высвобождения абортивного транскрипта, либо для перехода комплекса к стадии элонгации. В случае высвобождения абортивного транскрипта, продукт диссоциирует из комплекса через вторичный канал, РНКП возвращае
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.