ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2015, том 62, № 5, с. 696-707
^_ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ
СТАТЬИ
УДК 581.174.1/2:582.263:577.344
ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ПЛАСТИЧНОСТЬ СИМБИОТИЧЕСКИХ
МИКРОВОДОРОСЛЕЙ РОДА ВеБтойгБтт (Chloгophyceae) ИЗ БЕЛОМОРСКИХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ РАЗНЫХ ТАКСОНОВ
© 2015 г. А. Е. Соловченко*, **, О. А. Горелова*, О. И. Баулина*, И. О. Селях*, Л. Р. Семенова*,
О. Б. Чивкунова*, П. Н. Щербаков*, Е. С. Лобакова*
*Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва **Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений
им. К.А. Тимирязева РАН, Москва Поступила в редакцию 18.02.2015 г.
Впервые изучена физиологическая гетерогенность близкородственных симбиотических водорослей из таксономически удаленных животных-хозяев на примере трех штаммов одноклеточных водорослей из рода Desmodesmus (СЫогорЬусеае), выделенных из донных беспозвоночных Белого моря. Охарактеризовано влияние азотного голодания и света высокой интенсивности на рост, динамику содержания хлорофиллов (Хл), суммарных каротиноидов (Кар) и жирных кислот (ЖК) липидов клеток. У всех изученных штаммов азотное голодание вызывало снижение скорости накопления биомассы, а также содержания Хл и Кар в клетках на фоне накопления суммы ЖК липидов. Ультраструктурное исследование выявило редукцию фотосинтетического аппарата и увеличение доли объема клетки, занятого олеосомами и крахмальными зернами, а также утолщение клеточной стенки. Снижение эффективной освещенности клеток в более плотных культурах, как правило, замедляло изменения пигментного состава и профиля ЖК, вызванные азотным голоданием. В большинстве случаев содержание Хл снижалось быстрее, чем содержание Кар. У двух из трех изученных штаммов этот процесс протекал синхронно со снижением ненасыщенности ЖК липидов. Обсуждаются возможности биотехнологического применения симбиотических микроводорослей с учетом особенностей их физиологии в условиях стресса.
Ключевые слова: Desmodesmus — дефицит азота — жирные кислоты — каротиноиды — хлорофиллы — сильный свет — симбиотические микроводоросли — фотоадаптация — ультраструктура
БО1: 10.7868/80015330315050164
ВВЕДЕНИЕ
Симбиотические одноклеточные фототрофы — представители зеленых водорослей (СЫогорИуа, СЫогорИусеае), особенно симбионты фауны субарктических морей, практически не изучены по сравнению со свободноживущими микроводорослями (МВ) из этой группы. Тем не менее, эти организмы весьма интересны, поскольку обладают редким для свободноживущих МВ уровнем толерантности к неблагоприятным условиям среды (таким, как избыток или недостаток света, нитрат-
Сокращения: АЛК — а-линоленовая кислота; Кар — кароти-ноид(ы); МВ — микроводоросли; ОК — олеиновая кислота; Ос — олеосомы; ТАГ — триацилглицерины; Хл — хлоро-филл(ы).
Адрес для корреспонденции: Соловченко Алексей Евгеньевич. 119234 Москва ГСП-1, Ленинские горы, 1, корп. 12. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра биоинженерии. Факс: 007 (495) 939-38-07; электронная почта: 8о1оусИепко@шаП.Ыо.ш8и.ги
ного азота и С02), а также высоким биотехнологическим потенциалом [1, 2]. Кроме того, симбиотические МВ — хорошая модель для изучения ассимиляции и распределения углерода между компартментами клетки МВ при действии абиотических стрессоров [3]. Одна из гипотез связывает особенности физиологии симбиотических МВ с особенностями их среды обитания в теле животного-хозяина и климатическими условиями высоких широт [2, 4]. С другой стороны, пока не ясно, в какой мере наличие этих особенностей связано именно с влиянием симбиотического образа жизни. В связи с этим особый интерес представляет изучение близкородственных МВ — фо-тобионтов различных животных-хозяев.
Ранее в нашей лаборатории был выделен ряд штаммов зеленых МВ из донных беспозвоночных Белого моря [5, 6]. При этом из различных донных животных были изолированы близкородственные МВ, в дальнейшем отнесенные нами к
Таблица 1. Происхождение штаммов Desmodesmus, использованных в данной работе, и локусы, выбранные для их молекулярной идентификации [4]
Штамм, происхождение Локус, Генбанк ID
rbcL ITS1-5.8S rRNA-ITS2
2C166E, гидроид Coryne lovenii (M. Sars, 1846) 1Pm66B, трохофорная личинка полихеты Phyllodoce maculata (L., 1767) 1Hp86E-2, губка Halichondriapanicea (Pallas, 1766) KJ463407 KJ463406 KJ463408 JQ313131.1 JQ313134.1 JQ313133.1
роду Desmodesmus [4]. Достаточно подробно к настоящему времени исследованы только физиологические особенности симбионтов гидроида Dynamena pumila — МВ Desmodesmus 8р. 3Dp86E-1. Для них были выявлены некоторые закономерности ответов фотосинтетического аппарата, пигментного и липидного метаболизма на действие света высокой интенсивности и дефицита связанного азота в среде [1, 3]. В частности, действие стрессовых факторов, замедляющих деление клеток, приводило к дисбалансу между фотосинтетической фиксацией углерода и утилизацией фото-ассимилятов для построения клеточных структур. Как следствие, у Desmodesmus 8р. 3Dp86E-1, как и у свободноживущих представителей СЫогорИусе-ае, наблюдался усиленный биосинтез запасных липидов, главным образом триацилглицеринов (ТАГ), а также увеличение числа и размеров клеточных структур, в которых откладываются запасные соединения, богатые углеродом [3, 7—9].
В настоящей работе впервые сравниваются стрессовые ответы близкородственных симбио-тических МВ из рода Desmodesmus, выделенных из таксономически удаленных видов донных беспозвоночных животных (гидроиды, полихеты, губки). Показано, что все исследованные штаммы обладают значительной физиологической и ультраструктурной пластичностью, позволяющей успешно выдерживать комбинированное действие света высокой интенсивности и дефицита азота. При этом отдельные штаммы существенно различались по интенсивности и скорости ответов на высокую интенсивность света и дефицит связанного азота в среде культивирования.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования служили зеленые МВ, выделенные из донных животных Белого моря (табл. 1) [4]. Клетки МВ выращивали по ранее описанной методике [1, 3] в 600 мл среды BG-11 с полным набором биогенных элементов, либо среды BG-110 (—не содержащей азота [10], в стеклянных цилиндрах диаметром 6.6 см и емкостью 1.5 л, при постоянном освещении светодиодными лампами белого света (480 мкмоль фото-нов/(м2 с) ФАР). Интенсивность освещения изме-
ряли квантометром LiCor 850 ("LiCor", США). Культуру непрерывно барботировали воздухом (0.3 л/(л культуры мин)) и поддерживали температуру 27°C. В различных опытах начальная плотность культуры (по содержанию хлорофилла, Хл) составляла 5, либо 25 мг/л.
Исходную культуру выращивали в колбах объемом 750 мл, содержащих 250 мл среды BG-11, при 27°C и 40 мкмоль фотонов/(м2 с) ФАР при постоянном перемешивании (120 об./мин). Для создания дефицита азота клетки, осажденные центрифугированием, трижды отмывали средой BG-110 и ресуспендировали в среде BG-110, после чего культуру выращивали в описанных выше условиях. Рост культур регистрировали по накоплению биомассы и хлорофиллов. Сухой вес определяли гравиметрически [3]. Остаточное содержание нитрата и ортофосфата в культуральной жидкости контролировали методом ионной хроматографии на хроматографе ICS 1600 ("Thermo Dionex", США) с кондуктометрическим детектором, аналитической колонкой IonPac AS12A (5 мкм; 2 х 250 мм) и предколонкой AG12A (5 мкм; 2 х 50 мм). Неорганические анионы элю-ировали изократически (подвижная фаза — карбонатный буфер: 2.7 ммоль Na2CO3 + 0.3 ммоль NaHCO3; скорость тока 0.3 мл/мин) при температуре 30°C.
Фотосинтетические пигменты экстрагировали из клеток МВ смесью хлороформа c метанолом (2 : 1 по объему), содержание Хл а и b, а также суммы каротиноидов (Кар) определяли в хлороформной фракции экстракта спектрофотометри-чески [1, 3], состав ЖК ацилсодержащих липидов клеток МВ анализировали методом ГЖХ-МС по ранее описанным методикам [1, 3].
Подготовку образцов для электронной микроскопии и их микроскопирование осуществляли, как было описано в работе [3].
Для каждого штамма и варианта культивирования выполнено не менее двух независимых экспериментов, каждый в трехкратной биологической повторности. Если не указано иное, на рисунках представлены средние значения и их стандартные ошибки.
U-3
(U
<ч =S
о 2 Г
С 1
0.3
,0.2
о 0.1
1-1 &
2 о
(а) 2C166E
Я
3
JSSl
4 -
1 -
9 12 15 18 0
(б) 1Pm66B
4 -
1 -
3 6 9 12 15 18 0 Время культивирования, сутки
(в) 1Hp86E-2 0.3>
Г 1 1
3 4-
-а
9 12 15 18
Рис. 1. Накопление биомассы культурами Ввзтоёвзтш 8рр. 2С166Е (а), 1Рт66В (б) и 1Нр86Е-2 (в) при культивировании на среде BG-11 (1, 2) и BG-110 (3, 4).
Начальная плотность культуры (по содержанию хлорофилла) составляла 5 (1, 3) или 25 мг/л (2, 4). На врезках показана средняя скорость накопления биомассы (ц).
2
5
5
5
4
1
2
4
3
3
2
2
2
4
0
3
6
3
6
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Кинетика накопления биомассы на полной среде и при дефиците азота
Штаммы характеризовались индивидуальными кинетическими особенностями роста и зависимости конечной величины накопления сухой массы от начальной плотности культуры и наличия в среде культивирования связанного азота (рис. 1). Максимальная скорость роста отмечена для культур штамма 1Нр86Е-2, не лимитированных дефицитом азота в среде (рис. 1в, кривые 1, 2), при отсутствии видимой лаг-фазы и признаков достижения стационарной фазы за 17 суток культивирования. И, напротив, для культур 2С166Е и 1Рт86В (кривые 1, 2 на рис. 1а и 1б) была характерна более низкая скорость роста, при этом конечное значение сухой массы на 17-е сутки культивирования было в 2—2.5 раза ниже, чем у 1Нр86Е-2. При этом ни в одной из культур, растущих на полной среде ВО-11, не наблюдали исчерпания связанного азота и фосфора в среде за 17 суток культивирования. С другой стороны, сравнительно низкая скорость роста этих штаммов может быть связана с дефицитом С02 при продувании атмосферным воздухом и (или) низкой эффективностью поглощения минеральных элементов из среды.
Влияние дефицита азота на кинетику нако
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.