ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 2, с. 197-204
УДК 581.1
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ АДАПТАЦИИ МОРСКОЙ МИКРОВОДОРОСЛИ Tetraselmis (Platymonas) viridis К РАЗЛИЧНОЙ СОЛЕНОСТИ СРЕДЫ
© 2004 г. И. Г. Стриж, Л. Г. Попова*, Ю. В. Балнокин*
Кафедра физиологии растений биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва * Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 09.07.2003 г.
Исследована способность морской микроводоросли Tetraselmis (Platymonas) viridis Rouch., в норме растущей в среде с концентрацией хлористого натрия 0.5 М, адаптироваться к условиям повышенной и пониженной солености среды. Показано, что клетки T. viridis могут осуществлять жизненный цикл в широком диапазоне наружных концентраций NaCl (от 0.01 М до 1.2 М NaCl), эффективно поддерживая в этом диапазоне ростовую и осморегуляторную функции, а также функцию ионного гомеостатирования цитоплазмы. На везикулах плазмалеммы, полученных из клеток водоросли, адаптированной к различным концентрациям NaCl (0.01, 0.05, 0.5 и 1.2 М), исследовано образование фосфорилированного интермедиата №+-АТФазы - фермента, ответственного за экспорт ионов Na+ из клеток T. viridis. Обнаружено, что №+-АТФаза функционирует в плазматической мембране клеток, растущих даже при крайне низкой концентрации NaCl (0.01 М). При выращивании водоросли в средах высокой солености наблюдается индукция биосинтеза нескольких белков, молекулярная масса которых близка к определенной ранее молекулярной массе №+-АТФазы, составляющей 100 кД. Полученные данные свидетельствуют в пользу предложенной ранее гипотезы об индукции новой изоформы №+-АТФазы в клетках T. viridis при выращивании последней в средах с высокими концентрациями NaCl.
Tetraselmis viridis - микроводоросли - адаптация - солеустойчивость - ионное гомеостатирова-ние -Na^-АТФаза
В последние годы большое внимание уделяется изучению клеточных механизмов ионного гомеостатирования и в особенности регуляции транспорта Na+ через плазматическую мембрану (ПМ). Показано, что ион-транспортирующие системы ПМ и, в частности системы транспорта Na+, являются важнейшими детерминантами солеус-тойчивости [1-6]. Установлено, что в условиях солевого стресса наблюдается индукция или активация механизмов ионного транспорта ПМ [7, 8].
Одним из модельных объектов для физиологических и биохимических исследований механизмов адаптации к засолению, в том числе для изучения механизмов ионного гомеостатирования на клеточном уровне, является морская зеленая микроводоросль Tetraselmis (Platymonas) viridis
Сокращения: ПМ - плазматическая мембрана; ПААГ - по-лиакриламидный гель.
Адрес для корреспонденции: Попова Лариса Геннадиевна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс 07(095)977-80-18; электронная почта: balnokin@ippras.ru
(класс Prasinophyceae). Задачей настоящей работы было исследование способности клеток T. viridis, в норме растущей в среде, содержащей 0.5 М NaCl, адаптироваться к средам как низкой (0.01 и 0.05 М NaCl), так и высокой (0.9 и 1.2 М NaCl) солености. Для этого в условиях различной солености среды исследовали ростовую функцию клеток T. viridis, а также их способность поддерживать ионный гомеостаз и осморегуляцию.
В ПМ T. viridis ранее была обнаружена ^^транспортирующая АТФаза [9, 10], которая, по-видимому, играет ключевую роль в ионном го-меостатировании цитоплазмы и, соответственно, вносит весомый вклад в солеустойчивость этой водоросли. Нами было высказано предположение, что в результате адаптации T. viridis к различному уровню засоления происходит изменение эффективности работы этого фермента [11]. Как известно, активация ион-транспортирующих систем ПМ, в частности Н+-АТФазы, в условиях повышенной концентрации NaCl возможна либо на уровне изменения экспрессии генов и/или усиления белкового синтеза, что приводит к увеличению содержания белка или замене одной изо-
формы фермента на другую, либо путем изменения кинетических свойств фермента за счет посттрансляционных модификаций [3, 12, 13]. Проведенные нами ранее исследования транспортных функций №+-АТФазы позволили предположить существование в ПМ T. viridis двух различающихся по кинетическим характеристикам изоформ этого фермента [11]. В настоящей работе с помощью электрофореза белков в полиакрила-мидном геле (ПААГ) и регистрации фосфорили-рованного интермедиата №+-АТФазы получены данные, свидетельствующие в пользу предложенной ранее гипотезы о том, что в клетках T. viridis существуют конститутивная и индуцибельная изо-формы Ка+-АТФазы. Конститутивная форма обнаруживается в клетках при выращивании водоросли в средах с любой концентрацией NaCl (от 0.01 до 1.2 М). Индуцибельная форма, по-видимому, появляется при адаптации водоросли к высокой солености среды.
МЕТОДИКА
Работу проводили на морской одноклеточной водоросли Tetraselmis (Platymonas) viridis Rouch. Водоросль культивировали в искусственной морской воде [14], концентрация NaCl в которой была 0.5 М (стандартная культура). Клетки стандартной культуры адаптировали в течение 3-4 нед. к различным уровням засоления (0.01, 0.05, 0.9 и 1.2 М NaCl).
Учет скорости роста культур проводили с помощью прямого подсчета клеток в камере Горяе-ва. Ростовые константы к определяли как наклон линейного участка зависимости логарифма числа клеток от времени [15].
Статистическая морфометрическая оценка состояния клеточных популяций была проведена с помощью лазерного дифракционного анализатора размеров частиц Malvern 3600 Ec (Великобритания), согласно [16]. Измерения выполнены на базе Государственного Океанографического Института.
Для определения внутриклеточного содержания ионов Na+ и К+ клетки отмывали от солей наружной среды центрифугированием в изотонических растворах маннита или смеси маннита и глицерина в присутствии 20 мМ Ca(NO3)2, согласно [17], и разрушали гипотоническим шоком в дистиллированной воде. Концентрации Na+ и К+ в суспензии разрушенных клеток определяли c помощью пламенного фотометра ("Carl Zeiss", Германия). Для оценки внутриклеточных концентраций ионов полученные количества Na+ и К+ соотносили с суммарным объемом клеток в суспензии. Объем клеток определяли методом Okamoto и Suzuki [18] по разности электропроводностей среды
и суспензии клеток, измеренных с помощью кондуктометра ОК 102/1 ("Radelkis", Венгрия).
Везикулы ПМ водоросли были получены по методу, разработанному ранее для культуры, растущей в среде, содержащей 0.5 М NaCl [14]. Метод основан на частичном протеолизе гликопро-теиновой клеточной стенки водоросли и разрушении клеток мягким гипоосмотическим шоком, с последующим разделением клеточных мембран дифференциальным центрифугированием и центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Исходная методика была модифицирована в данной работе для клеток, выращиваемых при разной солености среды. В основу модификаций были положены изменения концентраций глицерина, используемого в качестве осмотика при проведении гипоосмотического шока.
Содержание белка в препаратах определяли методом Simpson и Sonne [19], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.
Полипептидный состав ПМ анализировали методом электрофореза в ПААГ в присутствии Na-ДДС по методу Laemmli с использованием 10%-ного разделяющего геля [20]. Окрашенные красителем Кумасси R-250 гели анализировали с помощью денситометра CD 50 ("Desaga", Германия).
Фосфорилирование белков ПМ в присутствии [у-32Р]АТФ и ионов Na+ осуществляли согласно описанной ранее методике [21]. После фосфори-лирования белки ПМ разделяли с помощью электрофореза в кислом (pH 2.4) ПААГ (5.6%) в присутствии Na-ДДС, согласно [22], и проводили авторадиографию гелей.
Все эксперименты, представленные в работе, были проведены не менее трех раз. Каждая точка на графиках представляет среднее значение из трех проб. Бары означают стандартную ошибку. Солеиндуцированные изменения в полипептидном спектре анализировали по результатам не менее чем 5 независимых экспериментов. На иллюстрациях представлены результаты, отражающие средние значения, либо являющиеся наиболее типичными.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ростовые характеристики Т. viridis, адаптированной к средам различной солености
Объективным показателем способности одноклеточных водорослей адаптироваться к какому-либо неблагоприятному фактору внешней среды является высокая скорость роста в условиях действия этого фактора [23]. Для оценки способности T. viridis адаптироваться к условиям различной солености среды была исследована динамика плотности культур водоросли, адаптированной к различным концентрациям NaCl (0.01, 0.05, 0.5,
0.9, 1.2 М). Полученные для всех культур ростовые кривые являются типичными кинетическими кривыми роста клеточных культур (рис. 1). Продолжительность лаг-фазы составляла около двух суток для клеток, выращиваемых при 0.05 и 0.5 М NaCl, и 5-6 сут - для клеток, выращиваемых при 0.01 и 1.2 М NaCl. Значения ростовых констант, отражающих скорость деления клеток в логарифмической фазе, у культур, адаптированных к различному уровню засоления, различались незначительно, кроме культуры, адаптированной к 1.2 М NaCl (рис. 1, вставка). Время удвоения числа клеток в экспоненциальной фазе роста практически не различалось у водорослей, адаптированных к 0.05 и 0.5 М NaCl (20 ± 3 ч), а у клеток T. viridis, выращиваемых при 0.01 и 0.9 М NaCl, составляло 30 ± 3 ч. Клетки водоросли, адаптированной к крайне высокой концентрации NaCl (1.2 М), характеризовались низкой скоростью деления (время удвоения 52 ± 2 ч). Заметное различие между культурами T. viridis, адаптированной к низким и высоким концентрациям NaCl, состояло в конечной плотности клеток, при которой водоросли переходили в стационарную фазу роста. Клетки водоросли, адаптированной к 0.05 и 0.5 М NaCl, замедляли деление на 7-8-е сутки при достижении плотности 11-12 млн. кл./мл. Переход в стационарную фазу роста у клеток, адаптированных к 0.9 и 1.2 М NaCl, происходил на 7-8-е и 9-10-е сутки, соответственно, при плотности культуры около 7-8 млн. кл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.