МИКРОБИОЛОГИЯ, 2009, том 78, № 5, с. 612-617
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.841.083.13
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И ЭМИССИОННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ РНОТОВЛСТЕЯШМ РНОЗРНОЯЕиМ
ИЗ БЕЛОГО МОРЯ
© 2009 г. В. В. Куц, А. Д. Исмаилов 1
Кафедра микробиологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова Поступила в редакцию 18.11.2008 г.
Проведен анализ ростовых и эмиссионных параметров светящейся бактерии из Белого моря (РНоШЪас-Твгшш рЬо8рЬогват, штамм КМ МГУ № 331), выделенной из кишечника донной рыбы керчака европейского МуохосерЪа\и& scorpius. Штамм отличается высокой скоростью образования колоний с интенсивной эмиссией света на агаризованной среде при 4°С и высокоэффективной (5 х 105 квант / (с кл)) и длительной (более 100 ч) генерацией света в глубинной культуре при 20°С. Кислотный сдвиг рН среды за период культивирования не превышает 0.3 ед. Изучено действие температуры, рН, концентрации хлорида № на эмиссионные характеристики интактных клеток фотобактерий. Температурный оптимум свечения 15°С. Максимальный уровень люминесцентной активности клеток стабилен в широком диапазоне рН от 7.0 до 9.0. Диапазон солевой зависимости 0.2-3.8% №С1 с максимумом при 2.5%. Полученные результаты подтверждают литературные данные, что адаптированные к низкотемпературным условиям среды обитания светящиеся бактерии обладают высокосопряженной системой переноса электронов на люциферазу.
Ключевые слова: Photobacterium phosphoreum, биолюминесценция, культивирование, температура, pH, хлорид Na.
Экологическое распределение морских видов фотобактерий четко коррелирует с температурным режимом морской воды [1-3]. Показана прямая связь между глубиной океана, температурным градиентом и таксономической композицией видов фотобактерий [4-6]. Преимущество на глубинах ниже 200 м при температуре воды ниже 15°С имели пси-хрофильные штаммы Photobacterium phosphoreum, в то время как в верхних слоях доминировал мезо-фильный вид Vibrio harveyi.
Психрофильные фотобактерии P. phosphoreum отличаются, кроме морфологических и физиологических признаков, наиболее длительным и интенсивным свечением [1, 7]. Удельная активность описанных штаммов P. phosphoreum, наивысшая среди всех видов, достигает значений 5 х 104-105 квант / (с кл), в то время как у большинства мезофильных штаммов V. harveyi и V. fischeri на порядок ниже [8, 9].
Совокупность накопленного материала по культивированию фотобактерий позволяет выделить в мультиплетном контроле роста и свечения доминирующие физиологические процессы. В первую очередь к ним относятся восстановительный потенциал клетки, пул АТР и сопряженность цепи переноса электронов на люциферазу, которые поддержива-
1 Адресат для корреспонденции (е-mail: anvaris@list.ru).
ют восстановленное состояние флавинового и обеспечивают биосинтез альдегидного субстратов. Значительное влияние на эти процессы оказывает сдвиг рН среды во время роста бактерий кислыми продуктами их метаболизма. Автокаталитическое закисле-ние среды растущей популяцией подавляет эмиссионную активность [1, 8]. Величина сдвига варьирует у разных видов и штаммов фотобактерий от 0.5 до 2.0 ед. рН [9, 10]. Принципиально, что у темновых мутантов скорость закисления среды существенно выше, чем у дикого типа [10].
Непосредственное воздействие на эмиссионную активность бактерий оказывают температура, рН, ионы №. Вместе с тем данные по оптимальным значениям рН, солевой и температурной зависимости свечения различаются не только для разных видов, но и штаммов фотобактерий [5-7]. Для большинства штаммов P. phosphoreum температурный диапазон свечения 2-30°С, с максимумом при 15-18°С [7, 9]. При температурах, превышающих на 10-15°С оптимальные, происходит частичная или полная утрата свечения бактериями [12]. Природа потери свечения при повышенных температурах не изучена. Большинство работ либо ограничивается простым описанием температурного профиля свечения штаммов [2, 6, 11] без объяснения механизма температурного воздействия на клеточные структуры, ли-
бо сводит проблему к общему заключению об образовании темновых мутантов [12]. Более того, без внимания остается вопрос о критических значениях доз "температура/время" обратимого и необратимого воздействия на свечение у разных видов и штаммов фотобактерий.
У разных штаммов P. phosphoreum pH-оптимум свечения варьирует от 7.0 до 8.5 [7, 11, 13]. Наряду со штаммовыми особенностями, эти расхождения могут быть также связаны с композицией буферной системы и физико-химическими условиями процедуры определения. Солевая зависимость люминесцентной активности в целом проявляется в диапазоне концентраций от 0.5 до 6.0% NaCl [7, 11, 13] и также варьирует у разных штаммов бактерий P. phosphoreum.
В комплексе перечисленные факторы влияют на люминесцентный цикл, длительность и интенсивность которого специфичны для каждого вида бактерий. Люминесцентный цикл у V. harveyi короткий (12-14 ч) и полностью завершается в логарифмической фазе роста, у V. fischeri - 20-24 ч, в то время как у P. phosphoreum стабильное свечение наиболее продолжительное (1.5-2 сут) [10, 13]. При этом в физиологических характеристиках бактерий разных видов проявляется их адаптация к физико-химическим условиям среды обитания [3, 4, 6].
Исходя из имеющихся данных по температурному контролю ростовых и эмиссионных параметров у разных видов фотобактерий, можно было ожидать наличия штаммов с высокоэффективной и длительной генерацией света не только в глубинах океана, но и в поверхностных зонах акваторий с низкой среднегодовой температурой. Температурный режим Белого моря оптимален для обитания психро-фильных видов фотобактерий. Температура поверхности воды Белого моря в летний период не превышает 15°С.
В представленной работе впервые охарактеризованы ростовые и люминесцентные свойства светящихся бактерий, выделенных из кишечника рыб Белого моря.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследований была светящаяся бактерия Photobacterium phosphoreum, штамм КМ МГУ № 331, выделенная из кишечника донной рыбы кер-чака европейского Myoxocephalus scorpius, обитающего в прибрежной зоне Кандалакшского залива Белого моря. Для сравнительного анализа эмиссионных характеристик использован штамм P. phosphoreum ATCC 11040.
Культивирование бактерий. Выращивание бактерий проводили на агаризованной среде состава, г/л: МПА (Оболенск) - 12.5; NaCl - 28.7; MgCl2 ■ ■ 7H2O - 4.5; CaCl2 - 0.5; KCl - 0.5; дрожжевой экс-
тракт - 1.0; агар-агар - 12.0; pH 7.6 при 4°С, и в глубинной культуре на среде состава, г/л: NaCl - 30.0; Na2HPO4 - 5.3; KH2PO4 ■ 2H2O - 2.1; (NH4)HPO4 - 0.5; MgSO4 ■ 7H2O - 0.1; дрожжевой экстракт - 1.0; пептон - 5.0; глицерин - 3.0; pH 7.6 при 20°С на качалке (200 об/мин, колбы вместимостью 700 мл, 150 мл среды культивирования). Инокулят выращивали на агаризованной среде в течение 24 ч при 4°С, смывали 2% NaCl и вносили по 5 мл клеточной суспензии (5 х 109 кл/мл) на колбу.
Ростовые параметры контролировали по оптической плотности при 660 нм на спектрофотометре "Beckman-26" (США). Концентрацию клеток определяли из калибровочного графика "оптическая плотность / число клеток". Люминесценцию регистрировали на люминометре 1250 LKB-Wallac (Швеция-Финляндия). Температурные зависимости снимали на счетчике импульсов RTF-20046 (Германия) с термостатируемым кюветным отделением. Измерение температуры проводили термодатчиком непосредственно в пробе с бактериями. Интенсивность эмиссии выражали в относительных единицах. Для количественного анализа выхода фотонов использовали стандарт Гастингса и Вебера [14]. Измерение рН проводили стандартным рН электродом на рН-метре "рН-340". Клетки бактерий осаждали центрифугированием (4000 g, 20 мин) и однократно отмывали от среды 0.1 М Na-фосфатным буфером с 2% NaCl, рН 7.6. Отмытые клетки ресуспендирова-ли в буферной среде того же состава и хранили при 4°С. Для определения рН-зависимости свечения клеток использовали 0.1 М Na-фосфатно-карбонатный буфер с 2% NaCl с разными значениями рН. Солевую зависимость свечения определяли в диапазоне концентраций NaCl 0.2-6%. Измерение эмиссионной активности в этих экспериментах проводили при комнатной температуре, после выхода свечения на максимальный уровень.
Все эксперименты на растущей культуре и ин-тактных клетках ставили в трех повторностях. Статистическая обработка результатов проведена с использованием стандартных программ Statistica for Windows 5.0, i-критерия Стьюдента, считая значимыми различия при p < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
При культивировании выделенного беломорского штамма фотобактерий на агаризованной среде при температуре 4°С был установлен высокоэффективный рост с интенсивной эмиссией через 14-16 ч после посева, минимум в 3 раза более высокий, чем у штамма АТСС 11040. Интенсивность эмиссии колоний определяли в биомассе, смытой охлажденной (4°С) культуральной средой и, в соответствии с калибровочной зависимостью "оптическая плотность / число клеток", нормировали на
Рис. 1. Динамика свечения (1) и роста (2) бактерий при глубинном культивировании при 20°С. Состав среды указан в "Материалах и методах".
pH
Рис. 2. Кинетика сдвига рН среды культивирования при глубинном росте бактерий при 20°С. Состав среды указан в "Материалах и методах".
клетку. При 4°С люминесцентная активность бактерий составляла ~10% от активности при комнатной температуре. Свечение колоний при 4°С наблюдали до 1 месяца.
На рис. 1 представлены кривые роста и свечения при глубинном культивировании бактерий при температуре 20°С. Логарифмическая фаза роста в этих условиях - чуть более суток, стационарная фаза до 60 ч.
Уровень свечения пропорционально возрастает при росте численности бактерий и сохраняется в течение 3 сут в нерастущей культуре.
Спад эмиссионной активности в постстационарной культуре менее 2 порядков по сравнению с максимальной.
Биолюминесцентная активность бактерий в оптимизированных условиях глубинного культивирования (22 ч роста, 20°С) достигает значений ~5 х 105 квант / (с кл), что превышает известные для других штаммов этого вида значения [7-9]. Это допол
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.