УДК 577.23
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МОДУЛЯТОРЫ ЦИКЛОСПОРИН А-НЕЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ ВНУТРЕННЕЙ МЕМБРАНЫ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ, ИНДУЦИРОВАННОЙ ИОНАМИ КАЛЬЦИЯ И а,ш-ГЕКСАДЕКАНДИОЛОВОЙ КИСЛОТОЙ
© 2013 г. М. В. Дубинин, А. А. Ведерников, С. И. Адакеева, Е. И. Хорошавина, В. Н. Самарцев*
Марийский государственный университет, 424001 Йошкар-Ола, пл. Ленина, 1; факс: (836-2) 56-57-81;
*электронная почта: samvic56@mail.ru Поступила в редакцию 29.04.2013 г.
В митохондриях печени, нагруженных Ca2+ или Sr2+, предельные длинноцепочечные а,ю-диоловые кислоты способны индуцировать неспецифическую проницаемость внутренней мембраны (открытие поры) по нечувствительному к циклоспорину А (ЦсА) механизму. В настоящей работе установлено, что Са2+ (200 мкМ) и а,ю-гексадекандиоловая кислота (20 мкМ, ГДК) в присутствии 1 мкМ ЦсА индуцируют высокоамплитудное набухание митохондрий печени, т.е. открытие поры во внутренней мембране происходит только при наличии субстрата окисления сукцината. В этих условиях протонофорный разобщитель окислительного фосфорилирования 2,4-динитрофенол в концентрации 75 мкМ, оптимальной для разобщающего действия, ингибирует набухание митохондрий, индуцированное Са2+ и ГДК, несмотря на присутствие сукцината в среде инкубации. Аналогично действуют и природные разобщители окислительного фосфорилирования — олеиновая и линолевая кислоты. Эти данные свидетельствуют о том, что одно из основных условий индукции ионами кальция и ГДК открытия поры в митохондриях печени — энергизация органелл, способствующая транспорту Са2+ в матрикс. Показано, что в условиях снижения концентрации свободного Са2+ в среде, ATP в физиологической концентрации 2 мМ ингибирует высокоамплитудное набухание митохондрий, индуцированное ГДК. Таким же действием обладает и ADP в той же концентрации. Подобное модулирующее действие нуклеотидов связано, по-видимому, с их способностью хелатировать Са2+. Поликатион спермин — известный блокатор классической ЦсА-чувствительной поры — в физиологической концентрации 1 мМ ингибировал и ЦсА-нечувствительное набухание митохондрий печени, индуцированное последовательным добавлением Са2+ и ГДК. Предполагается, что действие спермина определяется его способностью экранировать отрицательные поверхностные заряды на внутренней мембране митохондрий. Бычий сывороточный альбумин (БСА), связывающий свободные жирные кислоты и тем самым препятствующий индукции Са2+-зависимой поры, ингибировал и ГДК-индуцированное набухание митохондрий. Однако при одинаковом молярном соотношении БСА/жирная кислота ингибирующий эффект БСА был менее выражен при индукции поры ГДК, чем пальмитиновой кислотой. Это различие, возможно, обусловлено тем, что БСА хуже связывает а,ю-диоловые кислоты, чем их монокарбоновые аналоги.
Ключевые слова: митохондрии печени, а,ю-гексадекандиоловая кислота, циклоспорин А-нечувствительная пора, ионы кальция.
Б01: 10.7868/80233475513050034
Митохондрии позвоночных животных не только обеспечивают клетку АТР и теплом, они участвуют и в гибели клеток [1, 2]. Одним из связанных с митохондриями звеньев гибели клеток считается индукция кальций-зависимой неспецифической проницаемости внутренней мембраны (открытие поры). Открытие поры, в свою очередь, приводит к нарушению синтеза АТР в митохондриях, а также к выходу из межмембранного пространства в цитоплазму так называемых апо-
птогенных белков, таких как цитохром с, индуцирующий апоптоз фактор, эндонуклеазы О и др. [1, 2].
Эффективными природными индукторами открытия поры в митохондриях печени являются свободные монокарбоновые жирные кислоты [3—8], способные вызывать гибель не только клеток печени, но и других жизненно важных органов [1]. Жирные кислоты способны индуцировать "классическую" пору через взаимодействие с АЭР/АТР-ан-
типортером (известным как адениннуклеотид-транслоказа). В этом случае действие жирных кислот на митохондрии проявляется только в присутствии Са2+ (другие двухвалентные катионы неэффективны) и подавляется специфическим блокато-ром поры циклоспорином А (ЦсА) [8]. В отличие от поры классического типа индукция поры пальмитиновой и другими предельными жирными кислотами не подавляется ЦсА, и для индукции этой "неклассической" поры Са2+ может быть заменен ионами других двухвалентных катионов, например Sr2+ [3—7]. Полагают, что открытие этой поры происходит по механизму хемотропного фазового перехода, в основе которого лежит образование и последующая сегрегация комплексов Са2+ или Sr2+ с жирной кислотой в отдельные твердокристалличе-ские мембранные домены [5, 6].
В клетках печени при ю-окислении монокар-боновых жирных кислот образуются а,ю-дикар-боновые (диоловые) кислоты [9—11]. В нормальных физиологических условиях только 5—10% свободных жирных кислот метаболизируется по данному пути. Однако уровень а,ю-диоловых кислот в клетках печени значительно повышается при некоторых патологических состояниях (ожирение, голодание, сахарный диабет и др.), а также при различных нарушениях метаболизма моно-карбоновых жирных кислот [9—11]. Например, при синдроме Рея, который характеризуется острой энцефалопатией и жировой инфильтрацией печени [12], уровень а,ю-диоловых кислот в сыворотке крови детей повышается до 55% от общего количества свободных жирных кислот. При этом до 90% этих а,ю-диоловых кислот представлены длинноцепочечными (С14—С18) кислотами
[12]. Недавно нами показано, что в митохондриях печени, нагруженных Ca2+ или Sr2+, а,ю-диоло-вые кислоты (среди них наиболее эффективно а,ю-гексадекандиоловая кислота (ГДК)), способны индуцировать открытие "неклассической" поры, по механизму, нечувствительному к ЦсА
[13]. Очевидно, что имеющий важное биологическое значение процесс индукции неспецифической поры в митохондриях должен регулироваться в широких пределах, в том числе и с помощью физиологических модуляторов. Особый интерес представляют модуляторы, способные эффективно ингибировать открытие поры.
Известно большое количество ингибиторов "классической" ЦсА-чувствительной поры [14]. Из них наибольший интерес вызывают присутствующие in vivo в клетках и в межклеточных средах модуляторы, обладающие ингибирующим действием в физиологических концентрациях, — ADP, АТР, Mg2+, спермин и др., а также сывороточный альбумин, связывающий свободные жирные кислоты [14—16]. Эффективный путь инги-бирования "классической" поры — деэнергиза-ция митохондрий, вызванная разобщителями окислительного фосфорилирования, которая
препятствует транспорту Са2+ в матрикс органелл [14]. Данные о действии физиологических модуляторов "неклассической" ЦсА-нечувствитель-ной поры фрагментарны и противоречивы. Так, согласно [3], ADP и АТР не только не ингибиру-ют, но даже усиливают индукцию Са2+ и пальмитиновой кислотой ЦсА-нечувствительной поры. Однако в другой работе [6] показано ингибирую-щее действие АТР в физиологических концентрациях, что, по мнению ее авторов, может быть связано с известной способностью адениновых нук-леотидов хелатировать Са2+ (для комплексов ATP и ADP c Ca2+ Kd при pH 7.4 составляет 87 и 180 мкМ соответственно) [17]. Непредельные жирные кислоты (олеиновая, линолевая и др.), не обладая способностью вызывать образование Са2+-зави-симой "неклассической" поры, ингибируют аналогичное действие пальмитиновой кислоты [4, 7]. Неясно, в какой степени подобное действие непредельных жирных кислот связано с их активностью как эффективных протонофорных разобщителей [8, 18], приводящей к деэнергизации митохондрий. Установлено, что Mg2+ является сильным ингибитором митохондриальной Са2+-зависимой ЦсА-нечувствительной ("неклассической") поры, индуцированной Са2+ и пальмитиновой кислотой, что может быть связано с ингибированием кальциевого унипортера и (или) экранированием отрицательных поверхностных зарядов на мембране [6]. Поликатион спермин, известный как физиологический модулятор клеточных функций [19], еще более эффективно, чем Mg2+, способен экранировать отрицательные поверхностные заряды на мембране [20], а также влиять на транспорт Са2+ в митохондриях [21]. Однако о его действии как модулятора митохондриальной Са2+-зависимой "неклассической" поры до настоящего момента ничего неизвестно. К сказанному следует добавить, что практически отсутствуют какие-либо данные и о физиологических модуляторах "неклассической" поры, индуцируемой Са2+ и а,ю-диоловыми кислотами.
В настоящей работе предполагалось выяснить, как изменится влияние ГДК в качестве индуктора Са2+-зависимой "неклассической" поры в митохондриях печени при действии различных физиологических модуляторов, которые: а) вызывают деэнергизацию митохондрий (в отсутствие субстрата окисления, а также в присутствии разобщителей окислительного фосфорилирования); б) являются хелаторами ионов кальция (ATP и ADP); в) экранируют отрицательные поверхностные заряды на мембране, а также влияют на транспорт Са2+ в митохондриях (Mg2+ и спермин); г) связывают свободные жирные кислоты (бычий сывороточный альбумин (БСА)).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Опыты проводили на митохондриях, выделенных из печени белых половозрелых крыс (весом 210—250 г) методом дифференциального центрифугирования с последующим освобождением от эндогенных жирных кислот с помощью БСА [22]. Среда выделения содержала 250 мМ сахарозы, 1 мМ EGTA, 5 мМ Mops (рН до 7.4 доводили три-сом). Концентрацию белка митохондрий определяли биуретовым методом, в качестве стандарта использовали раствор БСА. Дыхание митохондрий регистрировали полярографическим методом при 25°С в термостатируемой ячейке объемом 1 мл. Набухание митохондрий определяли по изменению оптической плотности суспензии митохондрий (А) при длине волны 540 нм в кювете объемом 4 мл и температуре 25°С. Проницаемость внутренней мембраны митохондрий для Ca2+ определяли с помощью Са2+-селективного электрода в ячейке объемом 10 мл при температуре 25°С. При проведении исследований в ячейку или в кювету сразу после митохондрий (~0.8—1.0 мг/мл) добавляли ротенон (2 мкМ) и 1 мкМ ЦсА, все другие добавки — как указано на рисунках. Среда инкубации содержала 200 мМ сахарозы, 20 мМ KCl, 20 мкМ EGTA, 5 мМ янтарной кислоты
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.