РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, ТОМ 3(12), № 3-4, с. 227-234
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ТРАНСГЕННОЙ СВЕРХЭКСПРЕССИИ ПРЕДШЕСТВЕННИКА ИНТЕРЛЕЙКИНА-18
В ГЕПАТОЦИТАХ
© 2009 г. Т.Ю. Яковлева, Ш. Лют, К. Райфенберг*, А. Лозе
I. Медицинская Клиника, Университет им. Иоханнеса Гутенберга,
Майнц, Германия;
* Центральная лаборатория, Университет им. Иоханнеса Гутенберга
Майнц, Германия
Поступила: 15.06.2009. Принята: 05.08.2009
Интерлейкин-18 (ИЛ-18) проявляет патогенные свойства при различных заболеваниях печени. Для изучения роли ИЛ-18 в печени создана трансгенная мышиная модель с конститутивной сверхэкспрессией предшественника ИЛ-18 в гепатоцитах под контролем промотора гена альбумина мыши. При гистологическом исследовании выявлена спонтанная умеренная воспалительная активность в виде отдельных лимфоцитарных инфильтратов и повышенного количества Купфферовских клеток, а также усиление фиброгенеза в печени трансгенных мышей по сравнению с мышами дикого типа. С целью активации ИЛ-18 и изучения возможного гепатотоксического действия зрелой формы ИЛ-18 нами применена модель ЛПС-зависимого поражения печени без сенсибилизации или с предварительной сенсибилизацией мышей СрС-олигонуклеотидами. В этой модели гепатотоксичности последствия трансгенной сверхэкспрессии предшественника ИЛ-18 в гепатоцитах не оказали значимого влияния на степень поражения печени. Полученные в настоящей работе трансгенные мыши представляют собой животную модель для дальнейшего изучения роли ИЛ-18 in vivo при различных патологиях печени.
Ключевые слова: ИЛ-18, трансген, гепатоциты, липополисахариды, СрС-олигонуклео-тиды
ВВЕДЕНИЕ
Интерлейкин-18 (ИЛ-18) — провоспалитель-ный цитокин, впервые описанный в 1995 г. как фактор, индуцирующий продукцию ИФН-у. Он был выделен и очищен из печени мышей после последовательного введения им Propionibacterium acnes и липополисахаридов (ЛПС), причем эта обработка приводила к тяжелому ИЛ-18-зависимому поражению печени [1]. ИЛ-18 принадлежит к семейству ИЛ-1 и синтезируется в виде предшественника молекулярной массой 24 кДа (проИЛ-18), которая не содержит канонической сигнальной последовательности [2]. ПроИЛ-18 синтезируется конститутивно в иммунокомпетентных клетках и в некоторых не-гемопоэтических клет-
Адрес: Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin (DRFZ), Chariteplatz 1, Berlin 10117, Germany. E-mail: yakovleva@drfz.de
ках [3], причем зрелая активная форма ИЛ-18 с массой 18 кДа образуется и секретируется из клеток преимущественно в результате протеолитического расщепления проИЛ-18 каспазой-1 [4], после действия, например, ЛПС через То11-подобный рецептор 4. После секреции из клетки, ИЛ-18 проявляет свою биологическую активность, взаимодействуя с рецептором ИЛ-18 [5]. Образование лиганд-рецепторного комплекса приводит к активации провоспалительного фактора транскрипции ЫБ-кВ по классическому сигнальному пути врожденного иммунитета [6]. Рецептор ИЛ-18 экспрессируется на поверхности клеток ТЫ, но не на поверхности клеток Тк2 [7].
В присутствии ИЛ-12 ИЛ-18 приводит к дифференцировке наивных Т лимфоцитов в клетки ТЫ [8], а также к продукции ИФН-у, регулируя активность промотора гена ИФН-у [9]. К провоспалительным свойствам ИЛ-18 относится также его способность ин-
дуцировать продукцию таких цитокинов как ФНО, ИЛ-1|3 и ИЛ-8 [10]. Обладая хемотакти-ческими свойствами [11], а также способностью индуцировать продукцию хемокинов М1Р-1а, МСР-1 и молекулы адгезии лейкоцитов 1САМ-1 [12, 13], ИЛ-18 может влиять на инфильтрацию иммунных клеток в ткани. Кроме того, ИЛ-18 повышает цитотоксиче-скую активность NK- и CD8+ Т-клеток [14, 15] и увеличивает экспрессию FаsL на поверхности NK- и Th1 клеток [16, 17].
Биологические свойства ИЛ-18 зависят от его взаимодействия с другими цитокинами. В различных контекстах он может приводить к продукции не только Th1 цитокинов, но и Th2 цитокинов, таких как, например, ИЛ-4 и ИЛ-10 [18].
Считается, что ИЛ-18 может служить регулятором баланса Th1/Th2 хелперов в печени при различных патофизиологических состояниях печени [19], однако, точные механизмы его действия изучены недостаточно.
В настоящей работе для изучения роли ИЛ-18 в печени нами создана трансгенная модель с конститутивной сверхэкспрессией про-ИЛ-18 в гепатоцитах под контролем альбуминового промотора. Мы описываем фенотип таких мышей и приводим результаты экспериментов in vivo по изучению роли ИЛ-18 при ЛПС-зависимом поражении печени.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Получение трансгенных мышей
Для получения трансгенных мышей кДНК неактивной формы ИЛ-18 (проИЛ-18) (любезно предоставленная д-ром Нойрат, Университет Майнца, Германия) клонирована в экс-прессионный вектор рВК322/рВБК (получен от д-ра Хеннингера, Университет Майнца, Германия) в рестрикционный сайт Бша1. Полученная экспрессионная кассета была проверена секвенированием, переведена в линейную форму расщеплением по сайту KpnI и микроинъецирована в пронуклеус зигот FVB-NHSD мышей по стандартной методике. Интеграцию трансгена определяли при помощи ПЦР с использованием специфических праймеров 5'-ttt rtg сас аса сда 1са сс-3'^еше) и 5'ссс t^ сса с^ аас ttt gаt gtа-3'(аntisense). Полученные трансгенные линии поддерживали в гетерозиготном состоянии. Животные содержались в стерильных условиях.
Получение гепатоцитов
Для выделения гепатоцитов печень мыши перфузировали бескальциевым раствором (рН 7,4) и затем — 0,05% раствором коллагена-зы (рН 7,6). Клеточную суспензию фильтровали через ватно-марлевый фильтр в буферном растворе (рН 7,4) и центрифугировали.
Иммуноблотинг
На 15% акриламидный гель наносили по 25 мкг протеинов из очищенных гепатоцитов. Для положительного контроля использовали 25 мкг белка лизата клеточной линии макрофагов RAW 264.7. В качестве первичного антитела использовали анти-мышиные-ИЛ-18 IgG кролика (Тоггеу Pines Biolas, ^ston, USA) в разведении 1 : 2000, в качестве вторичного — пероксидаз-конъюгированные антикроличьи антитела козы (DAKO, Бепшагк) в разведении 1 : 1000. Детектирование проводили с помощью хемилюминесцентного метода и авторадиографии.
Гистология
Парафиновые и криосрезы печени толщиной 5 мкм готовили и окрашивали гематоксилин-эозином по стандартной методике.
Иммуногистохимический анализ проИЛ-18 проводили по методу авидин-биотин перокси-дазного комплекса (Elite Vectastain АВС-Kit, Vector Laboratories, Burlingame, СА, USA) на парафиновых срезах печени толщиной 5 мкм. Поликлональные анти-мышиные-ИЛ-18 IgG козы М-19 (Santa Cruz, №idelberg, Germany) использовали в качестве первичного антитела в разведении 1 : 100, биотинилированные анти-козьи IgG кролика — в качестве вторичного антитела (ABC-Kit). Для изотип-контроля применяли IgG козы, для негативного контроля — раствор фосфатного буфера (ПБС). Эндогенную пероксидазу блокировали в течение 5 мин 3% раствором перекиси водорода в метаноле. Для демаскирования антигена срезы помещали в 10 мМ цитратно-натриевый раствор и подвергали трехкратной 10 мин термальной обработке в микроволновой печи. Блокировку биотина на срезах производили при помощи авидин-биотин блокирующей системы (Avidin/Biotin Blocking Kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Для проявления окраски использовали субстрат ДДБ с последующей окраской срезов раствором гематоксилина.
Иммуногистохимическую окраску макрофагов печени проводили на парафиновых срезах печени толщиной 5 мкм с использованием первичных моноклональных анти-мышиных IgG2b крысы F4/80 (Serotec, Duesseldorf, Germany) в разведении 1 : 100 и вторичных пероксидаз-маркированных анти-крысиных антител кролика (DAKO, Denmark) в разведении 1 : 200. Демаскирования антигена достигали путем обработки срезов трипсином при 37 °С в течение 10 мин. Эндогенную пероксидазу блокировали 0,9% раствором перекиси водорода. Окраску проявляли с помощью субстрата ДАБ.
Для окраски коллагена печени парафиновые срезы толщиной 5 мкм обрабатывали раствором пикро-сириуса по Путчлеру.
Иммуноферментный анализ цитокинов в сыворотке
Для определения в сыворотке крови мышей активной формы ИЛ-18 использовали кит-набор (Мо^е IL-18 ELISA Kit, MBL, Nagoya, Japan). Уровень ИФН-у в сыворотке крови мышей определяли с использованием антител, полученных в Университете Майнца: первичные анти-мышиные-ИФН-у антитела — в разведении 1 : 500, вторичные биотинилиро-ванные антитела — в разведении 1 : 1000 в 1% растворе желатина. Определение уровня ИЛ-4 проводили с использованием анти-ИЛ-4 антител: первичные антитела — клон 11В11 в разведении 1 : 500, вторичные биотинилиро-ванные антитела — клон BVD6 — 24G2 в разведении 1 : 500 (BD Biosciences Pharmingen, Germany). Количество связанного биотина определяли после инкубации проб с авидин-пероксидазой (1 : 10 000) с помощью раствора тетраметилбензидина в субстрате, содержащем Н2О2.
Определение активности трансаминаз в сыворотке мышей
Измерение активности трансаминаз в сыворотке крови мышей проводили в Центральной лаборатории клиники Университета Майнца по стандартной методике.
Модель ЛПС-зависимого поражения печени in vivo
Для экспериментов по ЛПС-зависимой токсичности печени с предварительной сенсибилизацией СрG-олигонуклеотидами или без таковой, использовали по 7—10 трансгенных самцов и контрольную группу мышей
дикого типа на генетической основе гибрида FVB-NHSD в возрасте от 8 до 16 недель. Мышам вводили внутрибрюшинно 100 мкг ЛПС (Е. соИ, Sigma, Dеisenhofen, Germany). Для предварительной сенсибилизации мышам внутрибрюшинно инъецировали 40 мкг СрG-олигонуклеотидов (Roth, Karlsruhe, Germany) в первый день и 25 мкг СрG-олигонуклеоти-дов во второй день. Кровь для анализа брали из хвостовой вены через 8 ч после второй инъекции СрG-олигонуклеотидов. Через 8 ч после инъекций ЛПС определяли массу тела и печени, а также отбирали кровь путем пункции сердечной мышцы.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Получение трансгенных мышей, экспресси-рующих предшественник ИЛ-18
Для изучения иммунологической роли ИЛ-18 в печени мы создали трансгенных мышей с конститутивной экспрессией предшественника ИЛ-18 (проИЛ-18) в гепатоцитах под контролем альбуминового промотора. Тра
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.