МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 3, с. 323-330
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 579.852.083.18
физиологические свойства штаммов лсшпиювлсшт
¥ЕЯЮОХЮШ8, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ МЕСТОРОЖДЕНИЙ СУЛЬФИДНЫХ РУД РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН © 2015 г. З. К. Канаева*, А. Г. Булаев**, А. Т. Канаев***, Т. Ф. Кондратьева*, 1
*Институт высоких технологий и устойчивого развития Казахского национального технического университета им. К.И. Сатпаева **Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук ***Казахский Национальный университет имени Аль-Фараби Поступила в редакцию 16.07.2014 г.
Из ацидофильных микробных сообществ месторождений сульфидных руд Казахстана были выделены штаммы А. ferrooxidans и изучены их физиологические свойства, важные с позиции биотехнологии — определены оптимальная и предельные температуры роста, исследована устойчивость штаммов к №С1. Показано, что оптимумы температуры у штаммов совпадали (30—32°С), но диапазоны толерантности различались: при 37°С штамм ТБВК практически не окислял железо, тогда как скорость окисления железа при 37°С штаммом ТБУ была лишь незначительно ниже, чем при более низких температурах. Хлорид натрия ингибировал окислительную активность обоих штаммов. Окисление железа штаммом ТБУ ингибировалось 5 г/л №С1, а при концентрации №С1 20 г/л подавлялось практически полностью. Окисление железа штаммом ТБВК ингибировалось №С1 в меньшей степени: при концентрации №С1 10 г/л скорость окисления железа была достаточно высокой, при концентрации №С1 20 г/л железо окислялось с незначительной скоростью, но полностью окисление не подавлялось. Окисление штаммами серы подавлялось хлоридом натрия в меньшей степени, чем окисление двухвалентного железа. Окисление серы штаммом ТБУ заметно ингибировалось только при концентрации №С1 20 г/л, но не подавлялось полностью. Окисление серы штаммом ТБВК ингибировалось №С1 в большей степени. При концентрации №С1 10 г/л скорость окисления была значительно ниже, чем при меньших концентрациях №С1 (после 6 сут окисления при концентрации №С1 до 5 г/л в среде было около 130 мМ сульфата, а при концентрации 10 г/л — примерно 100 мМ). Окисление серы штаммом ТБВК заметно ингибировалось при концентрациях №С1 10 и 20 г/л, но также как и в случае штамма ТБУ не было ингибировано полностью. Результаты, полученные в данной работе, позволяют сделать вывод о приспособленности вида А. ferrooxidans к широкому диапазону условий роста.
Ключевые слова: ацидофильные микроорганизмы, Acidithiobacillus ferrooxidans, окисление железа, окисление серы, галотолерантность.
DOI: 10.7868/S002636561503009X
Acidithiobacillus ferrooxidans — первый описанный и наиболее изученный вид ацидофильных микроорганизмов, окисляющих сульфидные минералы [1, 2]. Микроорганизм — мезофил, обли-гатный автотроф, факультативный аэроб, получающий энергию при окислении ионов Fe2+, серы и ее соединений, сульфидных минералов, способен также к анаэробному окислению серных соединений и водорода, используя Fe3+ в качестве акцептора электронов. Показано, что вид является филогенетически гетерогенным, а физиологические свойства штаммов могут значительно различаться [3—7]. Ряд штаммов, исходно описанных как
1 Автор для корреспонденции (e-mail: kondr@inmi.host.ru).
A.ferrooxidans, вынесен в новые виды: А. fer-rivorans [8] и А. ferridurans [9] на основе их генетических, биохимических и физиологических характеристик.
Множеством исследований в области микробной экологии продемонстрировано, что благодаря физиологическому разнообразию штаммы A.ferrooxidans распространены повсеместно в местах окисления сульфидных минералов и зачастую являются доминирующими микроорганизмами в ацидофильных микробных сообществах [10].
Способность ацидофильных микроорганизмов к окислению сульфидных минералов сейчас широко используется в биогидрометаллургиче-ских технологиях для получения из сульфидных
руд цветных и благородных металлов [11]. Штаммы A.ferrooxidans и другие мезофильные микроорганизмы часто доминируют в процессах кучного биовыщелачивания, в которых окисление протекает не очень интенсивно и не происходит саморазогрева сырья [12]. Использование ацидофильных микроорганизмов в биогидрометаллургии делает изучение их биоразнообразия актуальным для микробиологии. В частности, мониторинг распространения в экосистемах месторождений сульфидных руд штаммов A.ferrooxidans и изучение их физиологических свойств на настоящий момент привлекает внимание исследователей различных стран [7, 12].
Гидрометаллургические технологии переработки руд требуют больших количеств воды, при этом месторождения металлов зачастую расположены в местах (пустыни Чили, Австралии), характеризующихся недостатком пресной воды. Это приводит к необходимости использования в биотехнологических операциях вод, содержащих высокие концентрации различных ионов [14]. Катионы щелочных и щелочноземельных металлов и анионы (сульфаты, хлориды), которые могут содержаться в жесткой воде в высоких концентрациях, подавляют рост и окислительную активность ацидофильных микроорганизмов. Показано, что наибольшим ингибирующим эффектом по сравнению с другими анионами (сульфатом, фосфатом), обладает хлорид [14, 15].
Республика Казахстан обладает богатой минерально-сырьевой базой и занимает лидирующие в мире позиции по запасам многих металлов [16]. На территории республики расположено большое количество месторождений сульфидных руд, что делает перспективным внедрение там биогид-рометаллуричеких технологий. В то же время многие месторождения на территории этого государства расположены в районах, испытывающих дефицит пресной воды, где внедрение в практику биогидрометаллургических технологий может столкнуться с необходимостью использования жестких вод. Поэтому актуальным с позиции как биотехнологии, так и микробной экологии месторождений сульфидных руд Казахстана является изучение экстремальных ацидофилов, устойчивых к различным ионам, содержащимся в жесткой воде, в частности, к хлориду.
Целью данного исследования являлось выделение штаммов А. ferrooxidans из ацидофильных микробных сообществ месторождений сульфидных руд Казахстана и изучение их важных для биотехнологии физиологических свойств: диапазонов температуры роста и концентрации №С1 в среде.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выделение чистых культур микроорганизмов и условия культивирования. Объектами для выделения микроорганизмов были пробы подотвальной воды забалансовых ураново-молибденовых руд уранового месторождения "Восток" и пиритно-арсенопритной руды месторождения "Бакыр-чик". Выделение штаммов A.ferrooxidans проводили при 30°C на среде 9К, содержащей в качестве источника энергии сульфат двухвалентного железа FeSO4 • 7H2O и используемой для культивирования железоокисляющих ацидитиобацил [17]. Были выделены накопительные культуры железоокисляющих мезофильных ацидофильных микроорганизмов. Чистые культуры выделяли методом десятикратных предельных разведений на тех же условиях. Бактерии выращивали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл со 100 мл среды на орбитальном шейкере (200 об/мин) при температуре 30°C.
Филогенетический анализ положения микроорганизмов методом секвенирования гена 16S рРНК.
Амплифицировали и секвенировали гены 16S рРНК, используя универсальные для большинства прокариот праймеры [18]. Амплификацию проводили на приборе Cetus 480 ("Perkin Elmer", Швеция) с применением термостабильной ДНК-полимеразы Bio Taq ("Диалат ЛТД", Москва), согласно рекомендациям фирмы-производителя. После очистки продуктов ПЦР на легкоплавкой агарозе и на колонках ("Promega", США) проводили секвенирование фрагментов генов 16S рРНК, используя набор Silver Sequencing ("Promega", США) согласно рекомендациям фирмы-производителя. Первичный анализ сходства полученных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК проводили с помощью сервера BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Выравнивание последовательностей с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий и построение филогенетического дерева исследуемых бактерий осуществляли с помощью пакета программ ClustalW2 и TreeDyn [19].
Световая микроскопия. Количественный учет микроорганизмов проводили методом прямого подсчета клеток с использованием светового микроскопа Ampival "Carl Zeiss" (ФРГ) с фазово-контрастной приставкой в 20 полях зрения.
Изучение физиологических свойств микроорганизмов. Влияние температуры на рост микроорганизмов изучали при их росте на среде 9K. Окисление штаммами элементарной серы исследовали при их росте на среде того же состава, но содержащей в качестве источника энергии элементарную серу вместо сульфата железа (10 г/л). При посеве на среду с элементарной серой добавляли на 100 мл среды 9К 0.1 мл раствора микроэлементов следующего состава (г/л): FeCl3 • 6H2O - 1.1, CuSO4 • 5H2O - 0.05,
0.002
-Acidithiobacillus ferrooxidans starin 2 (DQ909077.1)
Acidithiobacillus ferrooxidans YTW (DQ062116.1)
I Acidithiobacillus ferrooxidans 0L10-01 (JF891384.1) Acidithiobacillus ferrooxidans HZ-PKU-1 (HQ603786.1) — Acidithiobacillus ferrooxidans TFBK (KM192210)
Acidithiobacillus ferrooxidans starin TFV (KM192211)
Acidithiobacillus ferrooxidans starin ATCC 23270T (NR 074193.1)
-Acidithiobacillus ferrooxidans starin BY (DQ062117.1)
Acidithiobacillus ferrivorans SS3 (NR 074660.1)
Рис. 1. Дендрограмма нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК рода Acidithiobacillus, показывающая положение выделенных штаммов A. ferrooxidans TFBK и A. ferrooxidans TFV. Уровень bootstrap-поддержки более 70%. Последовательности, полученные в настоящей работе, выделены жирным шрифтом. Слева вверху дан масштаб эволюционных расстояний. Алгоритм — neighbor joining. В качестве outgroup использована последовательность гена 16S рРНК A. ferrivorans SS3 (NR 074660.1).
Н3ВО3 - 0.2, Мп804 • Н20 - 0.2, ШМо04 • 2Н20 -0.08, СоС12 • 6Н20 - 0.06, 2п804 • 7Н20 - 0.09. Значение рН доводили 10 N Н2804 до 2.4-2.5 при росте на 8°, до 1.7-1.8 при росте на Бе2+. При исследовании устойчивости микроорганизмов к различным концентрациям хлорида натрия его добавляли в среду в необходимой кон
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.