МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 1, с. 31-36
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.841.4.013:577.152.1
ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ТРАНСФОРМАНТОВ АЭРОБНЫХ МЕТИЛОБАКТЕРИЙ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕН ДИХЛОРМЕТАНДЕГАЛОГЕНАЗЫ dem A
© 2004 г. Ю. Е. Фирсова, Н. В. Доронина, Ю. А. Троценко*
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино
Поступила в редакцию 20.12.02 г.
Показано, что трансформанты Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4 (ДМ4-2сг -/pME 8220, ДМ4-2сг -/pME 8221) и Methylobacterium extorquens AMI (AM1/pME 8220 и AM1/pME 8221), экспрес-сирующие ген дихлорметандегалогеназы dcm A, лизируются при инкубировании с дихлорметаном и чувствительны к кислотному шоку. Установлено, что лизис клеток трансформантов не связан с накоплением токсичных концентраций Cl-, CH2O, HCOOH, нарушением синтеза глутатиона или поддержания pH;. Уровень включения [a-32P] дезокси АТФ фрагментом Кленова (exo) в ДНК трансформантов ДМ4-2cr-/pME 8220 и AM1/pME 8220 был существенно выше при инкубации клеток с CH2Cl2 по сравнению с CH3OH, что свидетельствует о значительном увеличении суммарной длины брешей. В то же время у штамма АМ1, не имеющего дихлорметандегалогеназы, и деструктора дих-лорметана - штамма ДМ4, наблюдалось лишь небольшое увеличение общей протяженности брешей в ДНК при инкубировании клеток с CH2Cl2. Вероятно, лизис клеток трансформантов, инкубируемых в среде с CH2Cl2, обусловлен недостаточно эффективной репарацией повреждений ДНК, образующихся в результате алкилирующего действия S-хлорметилглутатиона, промежуточного продукта деградации CH2Cl2. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости эффективной системы репарации ДНК в бактериальной минерализации дихлорметана.
Ключевые слова: аэробные метилобактерии, дихлорметан, дегалогенирование, трансформанты, экспрессирующие ген dcm A.
Дихлорметан (CH2Cl2, ДХМ) - высокотоксичное, канцерогенное соединение, широко применяется в промышленности в качестве растворителя и хладагента. Вследствие летучести, хорошей растворимости в воде и персистентности ДХМ рассматривается как опасный загрязнитель воздуха, водоемов и включен в список приоритетных поллю-тантов [1]. Это придает особую актуальность исследованиям механизмов биодеградации ДХМ (2-4). Выделены и идентифицированы 12 штаммов аэробных метилобактерий, использующих ДХМ в ка-
честве источника углерода и энергии. Многие изоляты оказались представителями новых таксонов метилобактерий (3 рода и 6 видов), реализующих разные пути Сгассимиляции [4]. Показано, что первичное дегалогенирование СН2С12 аэробными метилобактериями происходит в цитоплазме и катализируется ДХМ-дегалогеназой, относящейся к тета-классу семейства глутатион-Б-трансфераз [5]. Предполагается, что ДХМ-дегалогеназная реакция у аэробных метилобактерий осуществляется аналогично таковой в печени крыс:
CH2Cl2 + GSH -р [GS-CH2Cl] GS-CH2OH GSH + CH2O. HCl HCl
Образующийся короткоживущий интермедиат, S-хлорметилглутатион (GS-CH2Cl), спонтанно гидролизу ется до S-гидроксиметилглутатиона (GS-CH2OH), а последний разлагается до формальдегида и восстановленного глутатиона (GSH) [6]. Недавно установлено, что S-хлорметилглутатион дей-
* Адресат для корреспонденции (e-mail: trotsenko@ibpm.push-chino.ru).
ствует как мутаген и нарушает репликацию ДНК посредством алкилирования оснований [7].
ДХМ-дегалогеназа M. dichloromethanicum ДМ4 представляет собой цитоплазматический белок, кодируемый геном dcm A [5]. Этот ген был недавно клонирован и секвенирован, а также частично картирован соответствующий участок бактериального генома [8]. Рядом с геном dcm A локали-
зован ген dcm R, негативно регулирующий экспрессию структурного гена ДХМ-дегалогеназы на уровне транскрипции. В отсутствии ДХМ ген dcm R действует как репрессор гена dcm A, а при нарушении регуляторного гена имеет место конститутивный синтез ДХМ-дегалогеназ [9].
Однако различия между метилобактериями, способными и не способными использовать ДХМ, связаны не только с наличием или отсутствием ДХМ-дегалогеназы. Недавно получен ряд трансформантов метилобактерий, использующих метанол и экспрессирующих индуцибельно или конститутивно ген dcm A, но неспособных расти на ДХМ. Это предполагает, что в минерализации ДХМ наряду с ДХМ-дегалогеназой участвуют другие белки и гены [3, 10, 11]. Ранее был получен ДМ4-2сг мутант штамма M. dichloromethanicum ДМ4, утративший ген dcm A вследствие делеции на хромосоме или мегаплазмиде [10]. Установлено, что эта делеция не содержит других генов, необходимых для роста на ДХМ, кроме dcm A, так как ее удалось комплементировать при помощи плазмид pME 8220 и рМЕ 8221, несущих соответственно только dcm A или dcmA + dcm R, и получить растущие на ДХМ трансформанты ДМ4-2сг/рМЕ 8220 и ДМ4-2сг/рМЕ 8221 [12]. При помощи этих плазмид были также получены трансформанты ДМ4-2сг /рМЕ 8220 и ДМ4-2сг -/pME 8221, экс-прессирующие ген dcm A, но не способные расти на CH2Cl2. Не исключено, что это обусловлено возникновением новых мутаций, нарушающих функции генов, необходимых для роста на ДХМ. Кроме того, на основе M. extroquens AM1, не использующего CH2Cl2, были получены трансформанты АМ1/рМЕ 8220 и АМ1/рМЕ 8221, экспрес-сирующие ДХМ-дегалогеназу, но не способные расти на CH2Cl2. Эти трансформанты являются удобными моделями для выявления их отличий по сравнению с деструктором ДХМ M. dichloromethanicum ДМ4, что позволит в дальнейшем определить белки (гены), необходимые для роста на CH2Cl2 наряду с ДХМ-дегалогеназой (dcm A). Вероятными причинами отсутствия роста трансформантов на CH2Cl2 могут быть пониженный уровень синтеза глутатиона, нарушение рН го-меостаза вследствие внутриклеточного образования HCl, накопление в среде токсичных концентраций продуктов дегалогенирования CH2CL2 (CH2O, Cl), а также повреждения ДНК под действием S-хлорметилглутатиона. Выяснению, какой из этих потенциальных факторов определяет неспособность трансформантов расти на дихлорме-тане, посвящена данная работа.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы бактерий и условия культивирования. В работе использовали штаммы метилобактерий с сериновым путем Q-метаболизма Methy-
lobacterium dichloromethanicum ДМ4 [13] и Methy-lobacterium extorquens АМ1 (не имеет ДХМ-дегалогеназы и не растет на CH2Cl2, но растет на CH3OH), а также полученные на их основе трансформанты ДМ4-2ег /pME 8220, ДМ4-2ег /pME 8221, АМ1/рМЕ 8220 и АМ1/рМЕ 8221, экспрес-сирующие ген dcm A, но не способные расти на CH2Cl2. Плазмида pME 8220 несет ген dcm A и обеспечивает конститутивную экспрессию ДХМ-дегалогеназы из штамма ДМ4. Эта плазмида получена путем клонирования 1500 п.н. #indIII-Pst I фрагмента плазмиды pME 1540 [12] в векторе широкого круга хозяев рСМ 62 [14]. Плазмида рМЕ 8221 несет также ген dcm R, обусловливающий наличие лаг-фазы (15-20 ч) в экспрессии ДХМ-дегалогеназы. Плазмида рМЕ 8221 была получена клонированием 2000 п.н. BamH1 фрагмента плазмиды рМЕ 1518 [5], содержащего гены dcm A и dcm R в том же векторе рСМ 62. Полученные конструкции рМЕ 8220 и рМЕ 8221 были перенесены в штамм E. coli S 17-1, а затем в штаммы M. dichloromethanicum ДМ4-2ег и M. extorquens AM1 при помощи двуродительского скрещивания [12]. Штамм ДМ4-2ег лишен нативной ДХМ-дегалогеназы вследствие крупной (>21 т.п.н.) делеции на хромосоме или на невыявленной мегаплазмиде [10].
Культуры выращивали на жидкой минеральной среде "K" [13], содержащей в качестве источников углерода и энергии CH3OH (120 мМ) или CH2Cl2 (10 мМ), в стеклянных колбах на качалке (180 об/мин) при 29°C. При выращивании трансформантов в среду "K" добавляли тетрациклин (20 мг/л). При культивировании на CH2Cl2 колбы Эрленмейера объемом 300 мл с 50 мл среды закрывали завинчивающимися крышками с резиновой мембраной (Precision Sampling Corp., Baton Rouge, USA). CH2Cl2 добавляли в среду через мембрану шприцем до конечной концентрации 10 мМ по мере сдвига pH до 5.0 после доведения рН 3М NaOH до 7.2. Культивирование продолжали до второго, а в некоторых экспериментах - до третьего сдвига рН.
Определение внутриклеточного уровня глутатиона. Для определения общего пула глутатиона (суммарное содержание восстановленной и окисленной форм, GSH + GSSG) в бесклеточных экстрактах штаммов метилобактерий ДМ4 АМ1 и их трансформантов клетки, выращенные на CH3OH, отделяли от среды центрифугированием (10000 g, 20 мин) в конце логарифмической фазы роста (72 ч) и отмывали 0.05 М Трис-HCl буфером (рН 7.4). Биомассу (0.5 г по весу сырых клеток) суспендировали в 2.5 мл 0.01 N HCl и обрабатывали ультразвуком на аппарате MSE (Англия), мощностью 150 Вт при 20 кГц (6 х 30 е) при 4°C. Неразрушенные клетки и их фрагменты отделяли центрифугированием (20000 g, 40 мин). В бесклеточном экстракте определяли общий пул глутатиона спе-ктрофотометрическим методом [15] по образова-
нию восстановленной 5,5'-дитиобис-2-нитробен-зойной кислоты в присутствии глутатионредукта-зы (Sigma, США). Концентрацию глутатиона выражали в пересчете на 1 мг растворимого белка, который определяли в том же бесклеточном экстракте по методу Лоури.
Определение выживаемости клеток после инкубации с ДХМ и кислотного шока. Штаммы ДМ4, АМ1 и их трансформанты, выращенные на агаризованной среде с метанолом, переносили в свежую жидкую среду "K" с ДХМ и инкубировали до третьего сдвига рН до 5.0, но не более 96 ч. Параллельно анализировали содержание ионов хлора, формальдегида и формиата в культуральной жидкости. Затем среду нейтрализовали, добавляли равный объем свежей среды и 120 мМ CH3OH. Далее продолжали культивирование на качалке, контролируя изменение оптической плотности. Для определения выживаемости клеток после кислотного шока их выращивали 24 ч на среде с метанолом. Культуральную жидкость подкисляли 3М HCl или 3М HCOOH до рН 4 и 5 соответственно и продолжали инкубацию в течение 16 ч, после чего среду нейтрализовали 3М NaOH, добавляли 50 мМ CH3OH и культивировали в течение 6 сут. Прирост ОП выражали в % к контролю, в котором клетки не подвергались действию кислоты.
Определение внутриклеточного рН. рН; определяли по распределению [14C] бензойной кислоты (9.5 мкМ; 0.1 мкКи/мл, В/
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.