БИОФИЗИКА, 2010, том 55, вып.5, c.780-784
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА ==
УДК 577.3
ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ДЕЙСТВИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ФУЛЛЕРЕНА С60 НА АМИЛОИДНЫЕ ФИБРИЛЛЫ
АР(1-42)-ПЕПТИДА МОЗГА © 2010 г. А.Г. Бобылёв*, Л.Г. Марсагишвили*, З.А. Подлубная* **
*Учреждение Российской академии наук Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,
142290, Пущино Московской области; **Пущинский государственный университет, 142290, Пущино Московской области
E-mail: bobylev7@rambler.ru Поступила в p едакцию 23.06.10 г.
C помощью флуоресцентного анализа в in vitro амилоидных системах ЛР(1-42)-пептида мозга показана способность раствор имых в воде натр иевой соли поликарбоксильного производного фуллерена C60, фуллеренола и комплексов фуллерена C60 с поливинилпирролидоном (м.м. 25000 и 10000) разрушать амилоидные фибр иллы АР(1-42)-пептида мозга и пр едотвр ащать их обр азование. Результаты флуор есцентного анализа подтверждают данные, полученные нами р анее с помощью высокор азр ешающей микроскопии. Флуоресцентный анализ и электр онная микроскопия являются взаимодополняющими методами для отбор а эффективных антиамилоидных препаратов.
Ключевые слова: болезнь Альцгеймера, АД 1-42)-пептид, фуллерены, нейродегенеративные заболевания, тиофлавин Т.
Известно более 40 заболеваний человека, связанных с неправильным сворачиванием белков. К ним можно отнести амилоидозы, и в частности болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Паркинсона, катар акту, диабет II типа и др. [1,2]. Болезнь Альцгеймера - это одно из наиболее распро стр аненных и тяжелых невр ологи-ческих расстройств [3]. Отложения амилоидного Р-пептида в мозге являются одним из патологических признаков БА. Этот пептид - протео-литический продукт трансмембранного белка АРР и основной компонент амилоидных бляшек [4]. Множество данных свидетельствует в пользу того, что агрегация и аккумуляция нейроток-сичных АР-пептидов в мозге запускает каскад патологических р еакций, приводящих к нейро-нальной дисфункции и нейродегенерации [5-7]. Поэтому терапия БА направлена в основном на предотвращение агрегации АР-пептидов или разрушение этих агрегатов [8,9].
Одним из возможных подходов к разр уше-нию амилоидных фибрилл является использование фуллеренов, благодаря их уникальным свойствам. Известно, что молекулы фуллерена Сбо формируют внутримолекулярные и межмо-
Сокращения: БА - болезнь Альцгеймера, ПВП - поли-винилпирролидон.
лекулярные комплексы с ароматическими кольцами с пер ено сом заряда [10,11], из чего можно пр едположить возможность взаимодействия молекулы фуллерена Сб0 с радикалами ароматических аминокислот амилоидных фибрилл. Ким и Ли [12] на о сновании результатов, полученных с помощью флуоресцентного анализа, заключили, что пр оизводное фуллер ена (1,2-диметок-симетанофуллерен) подавляет агр егацию АР(1-40)-пептида. Мы провели визуальные исследования антиамилоидных свойств фуллер ена Сб0. Методом электронной микроскопии мы впервые продемонстрировали антиамилоидную способность гидратированного фуллер ена Сб0 (Сб0 HyFn) по отношению к фибриллам А Р(25-35)-пептида и АР(1-42)-пептида [13]. Проведенные эксперименты также показали, что введение в мозг крысам С60 HyFn положительно влияет на когнитивные процессы в норме, что свидетельствует об отсутствии нейротоксичности С60 HyFn [14]. Более того, установлено соответствие между описанным выше антиамилоидным действием C60 HyFn на амилоиды АР-пептидов in vitro и его способностью предотвращать нарушение решения когнитивных вероятностных задач у экспериментальных животных, индуцированное агрегированным АР(25-35)-пептидом [14].
Рис. 1. Модель связывания тиофлавина Т с амилоидными фибриллами; (а) - структура молекулы тиофлавина Т; (б) - схематическое изображение Р-слоя. Показаны цепочки атомов (Ы, С и Са) и радикал (Я) одного аминокислотного остатка. Тиофлавин Т, который связывается с фибриллой параллельно ее длинной оси, показан стрелкой; (в) -схематическое изображение протофибриллы с тремя Р-слоями. Молекулы красителя показаны стрелками [21].
Известно, что фуллерен Сб0 благодар я своей сферической форме и 30 двойным связям [15] может действовать как «губка свободных радикалов» [1 б—18]. Это важно, поскольку при болезни Альцгеймера увеличена пр одукция свободных радикалов в мозге [19]. К сожалению, вследствие низкой раствор имости в биологических жидкостях использование фуллеренов в качестве лекарственных препаратов ограничено [20]. Поэтому усилия учены х сосредоточены на синтезе растворимых в воде производных фул-леренов.
В этой работе мы тестир уем антиамилоидные свойства некоторых водораствор имых производных фуллерена Сбо.
Ряд авторов, изучающих антиамилоидные свойства разных веществ, используют метод флуор есцентного анализа, основанный на способности тиофлавина Т взаимодействовать с амилоидными фибриллами. При этом взаимодействии происходит увеличение интенсивности флуоресценции красителя при спектрофлуори-метрических измерениях и наблюдается желто -зеленая флуоресценция при флуоресцентно-микроскопических исследованиях. Молекула красителя состоит из бензтиазольного и аминобен-зольного колец, свободно вращающихся вокруг общей С-С-связи. К реб с и соавтор ы показали, что молекула тиофлавина Т связывается с амилоидными фибриллами специфически [21] и предположили, что связывание происходит в «каналах», которые тянутся вдоль Р-слоев (р ис. 1). Более того, тиофлавин Т связывается с ами-
лоидными фибриллами таким обр азом, что его молекулы оказываются параллельными друг другу и располагаются вдоль длинной оси фибриллы [21]. Было показано, что причиной возрастания интенсивности флуор есценции тиофлавина Т пр и его связывании с амилоидными фибриллами является жесткость окружения, препятствующая повороту бензтиазольного и аминобензольного колец молекулы друг относительно друга в возбужденном состоянии [22]. Благодаря таким уникальным флуоресцентным свойствам тиофлавин Т широко используют пр и изучении амилоидогенеза in vitro [23].
В данной работе представлены результаты in vitro тестирования флуоресцентным анализом эффектов растворимых в воде натриевой соли поликарбоксильного производного фуллерена C60 (C60Cl(C6H4CH2COONa)5), фуллеренола (по-лигидроксилированного производного фуллере-на C6o) и комплексов фуллер ена C60 с поливи-нилпирролидоном (C60 ПВП) (м.м. ПВП 25000 и 10000) на амилоидные фибриллы Аß(1-42)-пептида мозга (рис. 2).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Образование амилоидных фибрилл Aß(1-42)-пептидом. Использовали Aß(1-42)-пептид фирмы Sigma-Aldrkh ^ША). Фор мирование амилоидных фибрилл Aß(1-42)-пептидом было проведено в растворе, содержавшем 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, рН 7,0 в течение 24 ч при 37°C. Амилоидную природу фибр илл тестиро-
782
БОБЫЛЕВ и др.
Pис. 3. Результаты флуоресцентного анализа по влиянию производных фуллерена C60 и его комплексов с ПВП на амилоидные фибриллы Ав(1-42)-пептида. По о си абсцисс: 1 - А в(1-42)-пептид; 2 - А в (1-42)-пептид + фуллер енол, добавленный до фор мир ования фибр илл; 3 - Ав(1-42)-пептид + фуллеренол, добавленный по сле формирования фибрилл; 4 - Ав(1-42)-пептид + C60Cl(C6H4CH2COONa)5, добавленный до формирования фибрилл; 5 - Ав(1-42)-пептид + C60Cl(C6H4CH2COONa)5, добавленный после фор мир ования фибрилл; 6 - А в(1-42)-пеп-тид + комплекс фуллер ена C60 с ПВП (М = 25000), добавленный до фор мир ования фибр илл; 7 - А в(1-42)-пептид + комплекс фуллер ена C60 с ПВП (М = 25000), добавленный после фор мир ования фибр илл; 8 - Ав(1-42)-пептид + комплекс фуллер ена C60 с ПВП (М = 10000), добавленный до фор мир ования фибр илл; 9 - А в(1-42)-пептид + комплекс фулле-р ена C60 с ПВП (М = 10000), добавленный после фор мир ования фибр илл. По о си о р динат - интенсивность флуоресценции тиофлавина Т (À = 482 нм) (/фл, отн.ед.).
с помощью спектрофлуориметра CARY ЕсИр8е, Varían (Àex = 440 нм, Àem = 482 нм).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
P ис. 2. Стр уктур ы : фуллер енола (а ); натр иевой соли полиракбоксильного производного фуллерена -C60Cl(C6H4CH2COONa)5 (б); комплекса С60 с по-ливинилпирролидоном (ПВП) (в).
вали спектр офотометр ически по связыванию их с красителями конго красным и тиофлавином Т с помощью спектрофотометра CARY 100, Varían и спектрофлуориметра CARY ЕсИрзе, Varían. И сследуемые фуллер ены были добавлены к A ß(1-42)-пептиду до и после фор мир ования им амилоидных фиб р илл в соотношении 1:1 по весу, по сле чего пептид с добавленными фуллер енами инкубировали еще 24 ч при 37°C.
Флуоресцентный анализ. Интенсивность флуо -ресценции тиофлавина Т определяли в образцах, содержащих 30 мМ KCl и 10 мМ имидазола рН 7,0, 5 мкМ тиофлавина Т и 5 мкг/мл Aß(1-42)-пептида до и после формирования им амилоидных фибрилл
Р езультаты флуо р есцентного анализа пока -зали, что фуллер енол и натр иевая соль поли-кар боксильного производного фуллер ена Сб0 (Сб0С1(СбН4СН2СООМа)5) р азрушают амилоидные фибр иллы А в(1-42)-пептида, что пр иводит к значительному снижению интенсивно сти флуо р есценции тиофлавина Т (р и с. 3). А в(1-42)-пептид в пр исутствии этих пр оизводных фуллер ена Сб0, добавленны х до фор мир ования им амилоидных фибрилл, после 24 ч инкубации не увеличивает интенсивность флуоресценции тиофлавина Т. Это свидетельствует о способно сти исследуемых пр оизводных фуллер ена Сб0 предотвращать образование амилоидных фибр илл этим пептидом. Данные по антиамилоидному эффекту на Ав(1-42)-пептид мозга для натр иевой соли поликар боксильного пр оизвод-ного фуллер ена Сб0 были получены нами ранее с помощью высокоразрешающей электронной микроскопии [24].
ФЛУОРЕ СЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ДЕЙСТВИЯ
783
Также для разр аботки эффективных подходов к разрушению амилоидных фибрилл, образуемых А Р(1-42)-пептидом мозга, было проведено флуоресцентное изучение антиамилоидного эффекта комплексов фуллерена Сбо с по-ливинилпирролидоном (рис. 3).
Данные комплексы хорошо растворимы в воде и препятствуют агрегации наночастиц фул-лерена др уг с другом. Считается, что Сбо ПВП за счет высокой константы равновесия является более активным для биологических эффектов, чем Сбо, благодаря сильной устойчивости комплекса
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.