МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 1, с. 17-28
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ГЕНОМИКА. ^^^^^^ НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
УДК 577.2.082.261
ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ in situ В ИЗУЧЕНИИ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА
© 2004 г. А. В. Зеленин*
Институт молекулярной биологии им В.А. Энгелъгардта Российской академии наук, Москва, 119991
Поступила в редакцию 12.08.2003 г.
Одним из важнейших направлений в исследовании генома человека (как, впрочем, и геномов многих других организмов) является физическое картирование хромосом с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Эта методика, позволяющая локализовать на индивидуальных хромосомах и в их конкретных участках отдельные гены и анонимные последовательности ДНК, зародилась и претерпела бурное развитие в конце 80-х начале 90-х годов прошлого века, т.е. в период возникновения и становления международной и отечественной программ "Геном человека", и сыграла и продолжает играть весьма существенную роль в изучении этого генома. В статье рассматриваются основные этапы развития указанной методики. Ключевую роль при ее внедрении в исследовательскую практику нашей страны сыграли Новосибирский институт цитологии и генетики СО РАН и Московский институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта. Подробно рассматриваются работы, выполненные с помощью FISH-технологии в рамках отечественной программы "Геном человека" по физическому картированию хромосом 3 и 13. Подчеркивается значение, которое имело внедрение технологии флуоресцентной гибридизации in situ для развития в России смежных направлений науки, таких как сравнительная геномика животных (ZOO-FISH) и изучение хромосом растений.
Ключевые слова: геном человека, физическое картирование, FISH, онкогеномика.
КРАТКАЯ ИСТОРИЯ
Возможность локализации на хромосомах отдельных фрагментов ДНК той или иной длины впервые возникла в начале 70-х годов прошлого века. Был использован широко применявшийся в то время метод температурной денатурации-ре-натурации ДНК, который позволяет, при соблюдении необходимых условий, получить участок двуцепочечной ДНК, состоящей из представляющей интерес радиоактивно-меченой пробы и фрагмента геномной ДНК, по своему нуклеотид-ному составу комплементарной этой пробе. Выявление радиоактивности с помощью фотографической эмульсии позволяло установить расположение пробы на конкретной хромосоме, а при параллельном применении различных методов дифференциальной окраски - и на отдельном хромосомном локусе (бэнде). Вскоре метод радиоактивной гибридизации in situ начали активно использовать в геномике человека для локализации на хромосомах отдельных генов. Этому, однако, серьезно мешала трудоемкость работы, связанная с необходимостью подсчета под микроскопом мелких гранул серебра на десятках хромосомных пластинок.
Развитию этой методики в конце 80-х годов способствовало два практически одновременных
*Эл. почта: Azel@eimb.ru
события. С одной стороны, в связи с началом интенсивных работ по расшифровке генома человека резко увеличилось число ДНК-проб, "требующих" своего картирования на хромосомах. Это были как гены (вначале их было сравнительно немного), так и анонимные последовательности ДНК, создаваемые во все возрастающих количествах в процессе клонирования и секвенирования генома человека. Второе событие - изменение способа мечения локализуемой пробы: вместо радиоактивности начали использовать флуоресцентную метку - отсюда и появился термин FISH - от английского Fluorescense in situ Hybry-dization.
Преимущества нового подхода были очевидны: резко уменьшилось время проведения анализа, появилась возможность одновременно использовать две и более различные метки и отказаться от применения радиоактивных изотопов. Этого оказалось достаточным для того, чтобы в течение короткого времени метод FISH заменил радиоактивный.
Именно в этот момент, приблизительно в конце 1990 - начале 1991 г., меня пригласил к себе А.А. Баев. Точной даты этой беседы я назвать не могу, помню лишь, что научные и организационные контуры нашей программы были уже созданы, и велась постоянная напряженная работа по ее претворению в жизнь. Я принимал активное
участие в этой работе и как член бюро Научного совета программы, и как заместитель директора ИМБ, на долю которого выпала основная тяжесть работ по созданию и осуществлению программы.
Естественно, что с Александром Александровичем мне доводилось встречаться очень часто. Однако на этот раз разговор сразу же вышел за рамки текущих забот и принял, я бы сказал, научно-стратегический характер. Сначала Александр Александрович спросил меня, знаю ли я о гибридизации in situ и ее значении для картирования генома человека и, получив положительный ответ, поинтересовался положением дел в нашей стране. По имевшимся у меня сведениям, такие работы велись в Новосибирске в группе А.С. Графо-датского, однако в ограниченном масштабе. "А в Москве?" Ответить было нечего. Переждав несколько секунд, Александр Александрович неожиданно попросил меня напомнить, как называется моя лаборатория в Институте молекулярной биологии. Я ответил: "Лаборатория функциональной морфологии хромосом". После еще одной паузы, Александр Александрович неожиданно завершил разговор: "Так кому же, как не Вам, возглавить работу по овладению и внедрению в практику нашей программы методов гибридизации in situ. Разумеется, в ее современном флуоресцентном варианте. Вам как ученику и восприемнику по лаборатории Максима Николаевича Мейселя использование и развитие флуоресцентных методов анализа генома должно быть особенно близко. Совет по программе окажет необходимую помощь. В ближайшие дни жду Ваших соображений". Так к числу многих моих нагрузок прибавилась еще одна.
Вскоре стали ясными основные направления работы: поддержка реактивами и приборами тех зачаточных исследований, которые проводились в нашей стране, привлечение к активному изучению генома человека группы А.С. Графодатско-го, создание в ИМБ группы FISH, а также установление связей с лабораториями мира, ведущими активные исследования в области FISH1.
Первые работы с помощью гибридизации in situ были выполнены с использованием радиоактивной метки [1-3] и имели для нас, в основном, учебное значение. Однако вскоре мы стали применять флуоресцентную метку, что потребовало значительных усилий со стороны как московской, так и новосибирской групп. Естественно,
1В дальнейшем при рассмотрении работ по FISH-картиро-ванию генома мы будем ссылаться на группы ИМБ (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, Москва - А.В. Зеленин, О.В. Муравенко) и ИЦиГ (Институт цитологии и генетики СО РАН, Новисибирск -А.С. Графтодатский, Н.Б. Рубцов), ИОГен (Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова, Москва - Н.К. Янковский).
что основные работы по использованию и развитию метода гибридизации in situ проводили на основе ДНК-проб, получаемых в рамках проекта "Геном человека". Для изучения были выбраны четыре "российских" хромосомы - 3, 5, 13 и 19. Реально же исследования по картированию генома человека в рамках российской программы были сконцентрированы на хромосомах 3 и 13.
NotI КАРТИРОВАНИЕ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА С ПРЕИМУЩЕСТВЕННЫМ ВНИМАНИЕМ К ХРОМОСОМЕ 3 И ЕЕ ЛОКУСАМ, ЗАДЕЙСТВОВАННЫМ В КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ
Хромосома 3 к моменту начала работ по отечественной программе "Геном человека" уже была объектом совместного изучения ИМБ, Москва (лаборатория Л.Л. Киселева ) и Каролинского института, Стокгольм, Швеция (группа Е.Р. Заба-ровского). Эта одна из трех наиболее крупных хромосом человека. К этому времени было установлено, что ряд ее локусов связан с возникновением многих злокачественных опухолей. В качестве основного подхода к картированию этой хромосомы было избрано ее клонирование после обработки редкощепящей рестриктазой NotI и детальное изучение клонов из полученных "лин-кинг-джампинг" NotI-библиотек [4-9]. Работа по картированию полученных клонов с помощью метода FISH была начата сотрудниками лаборатории А.С. Графодатского (Васильева, Протопопов), но вскоре активное участие в них приняли сотрудники группы ИМБ (Кост-Алимова, Федорова и Муравенко). В совокупности, удалось локализовать на хромосоме 3 более 150 NotI клонов, большая часть из которых содержала вставки новых, ранее не локализованных, клонов или STS [10-18].
Задачей дальнейших исследований стало детальное изучение короткого плеча хромосомы 3, значение которого в развитии канцерогенеза особенно велико. При использовании FISH-картиро-вания было установлено, что потеря гетерозигот-ности, сопровождаемая делециями в коротком плече хромосомы 3 (3р), практически в 100% случаев обнаруживается при раке почки (RCC), мелкоклеточном раке легкого (SCLC) и в 90% - при немелкоклеточном раке легкого (NSCLC) и некоторых других злокачественных опухолях. На долю шести видов рака, при которых степень деле-тирования в р3 особенно высока (рак легкого, молочной железы, шейки матки, ротовой полости, яичников и почки) приходится 34% случаев общей смертности от онкологических заболеваний, что составляет более 2 млн. смертей в год [19-23].
Эти результаты позволили заключить, что короткое плечо хромосомы 3р3 содержит, по крайней мере, несколько генов-супрессоров ракового
роста, расположенных в локусе 3p21.3 центро-мернее гена LUCA и теломернее гена AP20 [23, 24]. При детальном изучении некоторых других участков хромосомы 3, в частности, при NotI-кар-тировании областей 3р26-р25, 3р22-р21 и 3р21-р31, были обнаружены аллельные делеции при опухолях почки человека [9, 14-18, 25].
Таким образом исследование NotI-клонов, специфичных для хромосомы 3, привело к обнаружению ряда генов-супрессоров опухолевого роста, ответственных за возникновение большинства видов рака человека. Кроме этого было показано, что в хромосоме 3 содержится несколько онкогенов, вовлеченных в канцерогенез [21, 22]. Поэтому, согласно современным представлениям, следует говорить о наличии в хромосоме не только генов-супрессоров опухолевого роста, но вообще генов, специфичных для раковых клеток (tumor specific genes).
Важным и естественным развитием этих исследований стало получение и детальное изучение тотальных No
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.