ш
УДК 577.(336+323)
ФЛУОРЕСЦЕНТНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЭНЕРГЕТИКИ НУКЛЕОТИД-АКТИНОМИЦИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ
© 2014 г. В. И. Ковалев, Н. Л. Векшин#
Институт биофизики клетки РАН, 142290, Пущино, Московская обл. ул. Институтская, 3 Поступила в редакцию 24.12.2013 г. Принята к печати 27.01.2014 г.
С помощью флуоресцентной спектроскопии изучены комплексы 7-аминоактиномицина Д (7ААМД) — флуоресцентного аналога природного противоопухолевого антибиотика актиномицина Д (АМД) с его потенциальными переносчиками: пуриновыми нуклеотидами (гуанином и аденином), кофеином и фрагментированной ДНК. Показано, что 7ААМД связывается на поверхности пуриновых агрегатов или кластеров кофеина и особенно хорошо встраивается в расплетенные участки ДНК. Это сопровождается значительным длинноволновым сдвигом спектра возбуждения 7ААМД. По величине сдвига найдена энергия взаимодействия. В случае взаимодействия 7ААМД с гуанином, аденином и кофеином она достигает около 7 ккал/моль, что мало отличается от энергии взаимодействия с ДНК — 7.7 ккал/моль. Это означает, что в ДНК вклад дезоксирибозы и фосфата в энергию взаимодействия очень мал. Судя по спектрам излучения, 7ААМД при взаимодействии со всеми исследованными веществами, кроме ДНК, флуоресцирует из водной фазы. Сделан вывод, что при фотовозбуждении 7ААМД легко уходит из всех исследованных кластеров в полярную водную фазу, но не выходит из ДНК, оставаясь в гидрофобном окружении. Прочность связывания 7ААМД с ДНК определяется, по-видимому, не только энтальпийной энергией взаимодействия, но и энтропийным стерическим фактором — нахождением антибиотика в гидрофобной области расплетенного участка.
Ключевые слова: аденин, гуанин, кофеин, фрагментированная ДНК, актиномицин, 7-аминоактиноми-цин, флуоресцентная спектроскопия.
Б01: 10.7868/80132342314040071
ВВЕДЕНИЕ
Одним из самых эффективных противоопухолевых природных антибиотиков является актиномицин Д (АМД), состоящий из феноксазонового гетероцикла и двух пептидолактонных колец [1, 2]. Его высокая цитостатическая активность обусловлена блокированием РНК-полимеразной реакции в ДНК, что ведет к прекращению синтеза белка и клеточного деления [3—5].
В кристаллах и сухих пленках ДНК наблюдается интеркаляция АМД по стэкинговому типу — между нуклеотидами двойной спирали. Однако в растворе ДНК происходит нестэкинговое встраивание (при физиологически малых концентрациях антибиотика) в расплетенные участки ДНК [6-9].
АМД является крупной амфифильной молекулой, плохо проникающей в опухолевые клетки. Чтобы усилить проникновение АМД в опухолевые клетки при его малых концентрациях, нужно использовать специальные носители-переносчи-
#Автор для связи (тел.: +7 (4967) 73-94-32, эл. почта: пуекБЫп@гатЪ1ег. ги).
ки. К сожалению, попытки доставки АМД в опухолевые клетки с помощью фосфолипидных ли-посом, полипептидов, антител, синтетических полимеров и поверхностно-активных веществ оказались не слишком удачными [10].
Актиномициновые антибиотики хорошо проникают в опухолевые клетки вместе со шпилечным олигонуклеотидом НР1 и кофеином [11]. На примере флуоресцирующего 7-аминоактиноми-цина Д (7ААМД), который можно детектировать в микромолярных концентрациях, было показано, что НР1 и кофеин позволяют резко снизить терапевтическую концентрацию антибиотика, но при этом усиливают противоопухолевое действие [12]. Это происходит за счет встраивания антибиотика в шпильку НР1 или в кофеиновый кластер, в результате чего облегчается его транспорт через мембраны. На клетках асцитной карциномы наблюдалось усиление проникновения АМД в комплексе с НР1 и кофеином внутрь клеток [12]. Причем, шпилька НР1 и кофеин не препятствуют перераспределению антибиотика к ДНК [13].
Синтез олигонуклеотидных шпилек трудоемок, а биологическое воздействие не всегда предсказуе-
мо. Поэтому именно кофеин и его аналоги могут стать наиболее удобными переносчиками [14], тем более, что аденин и гуанин активно расходуются при пролиферации быстроделящихся трансформированных клеток, что обеспечивает селективную доставку антибиотика преимущественно в раковые клетки.
В работе [15] с помощью ЯМР изучалась гете-роассоциация АМД с кофеином при их миллимо-лярных концентрациях. Однако столь высокие концентрации АМД не физиологичны. Более того, авторами работы [15] не было учтено, что при миллимолярных концентрациях в водных растворах кофеин и АМД находятся не в мономерном виде, а образуют упорядоченные агрегаты — кластеры [16—19].
Необходимо работать с меньшими количествами антибиотика и учитывать наличие агрегатов кофеина и его аналогов. В нашей лаборатории недавно была определена энергия взаимодействия АМД с нуклеотидами с помощью спектрофотомет-рии [6]. Целью же данной работы является высокочувствительное флуориметрическое изучение взаимодействия 7ААМД в малой (микромолярной, физиологической) концентрации с агрегатами аденина и гуанина, кластерами кофеина, а также с фрагментированной ДНК.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Пуриновые агрегаты и кластеры. Гуанин и аде-нин в дистиллированной воде при концентрации порядка 100 мкМ формируют агрегаты [16, 19]. Кофеин формирует небольшие упорядоченные агрегаты — кластеры, состоящие из 10—20 молекул [14—19] при миллимолярных концентрациях. Агрегация происходит за счет гидрофобных взаимодействий, а также водородных связей. Размер небольшого агрегата или кластера составляет около 50—150 А, что многократно меньше длины световой волны. Поэтому при формировании таких небольших агрегатов или кластеров раствор остается прозрачным (мутность пренебрежимо мала), то есть использованные в работе концентрации кофеина, аденина или гуанина — это предельные концентрации (количество молекул нук-леотидов в сотни раз превышает количество молекул 7ААМД; при увеличении концентрации нуклеотидов изменений энергетики происходить не будет, а вот осадок может начать выпадать). При агрегации гуанина, аденина или кофеина происходит снижение их молярного коэффициента поглощения (прежде всего за счет эффекта экранировочного гипохромизма — конкуренции стопкообразно расположенных гетероциклов за фотон [17], а также светорассеяния на крупных агрегатах), но не появляется новых полос, т.е. энергия взаимодействия между пуриновыми мо-
лекулами в агрегате не велика. Дальнейшее увеличение концентрации практически не влияет на молярный коэффициент поглощения.
Взаимодействие 7ААМД с гуанином. Некоторые исследователи предполагали [1, 2], что среди оснований ДНК максимальным сродством к АМД обладает гуанин. Поэтому можно было ожидать, что 7ААМД в водном растворе будет хорошо взаимодействовать с гуанином. В воде гуанин уже в концентрации 50 мкМ существует преимущественно в виде агрегатов [16, 19]. Важно заметить, что при добавлении 7ААМД (в низкой концентрации 2 х 10-6 М) к раствору гуанина, взятому в 50-кратно большей концентрации (1 х 10-4 М) частично образовывались гетероком-плексы. При взятом соотношении один гуанино-вый кластер может связать в среднем не более одной молекулы антибиотика. Часть молекул антибиотика сорбируется на поверхности кластеров, а часть может встраиваться внутрь. При этом происходит небольшое снижение молярного коэффициента поглощения 7ААМД, вызванное тем, что фотоны подвергаются некоторому светорассеянию на каждом из крупных агрегатов [16], не достигая встроенного в них антибиотика. Не смотря на это, квантовый выход флуоресценции 7ААМД заметно возрастает (за счет попадания хромофора антибиотика из воды в менее полярную фазу).
В спектре возбуждения 7ААМД в этих условиях наблюдается сдвиг (по отношению к свободному 7ААМД в воде) в длинноволновую сторону не менее чем на три десятка нанометров (рис. 1, табл. 1). При этом меняется форма спектра и его полуширина. Все это говорит о существенном перераспределении электронной плотности в молекуле 7ААМД, т.е. о довольно сильном взаимодействии с гуанином. Необходимо отметить, что спектры возбуждения по форме и положению похожи на спектры поглощения. Они несут информацию об электронно-колебательных переходах поглощения, хотя детектируются по интенсивности флуоресценции (чувствительность флуоресцентного метода в тысячу раз выше, чем спектро-фотометрического.
Энергия взаимодействия между 7ААМД и гуанином может быть оценена по спектральному сдвигу в шкале волновых чисел (см-1). Сдвиг (относительно 7ААМД в воде) в смеси с гуанином был равен 1400 см-1, что соответствует энергии (по известному соотношению Е=Н\, где к — постоянная Планка, V — волновое число) 4 ккал/моль (статистическая неточность в величине энергии составляет 0.3 ккал/моль).
Найденная величина отражает лишь нижнюю границу энергии взаимодействия, т.к. в спектре
Рис. 1. Спектр возбуждения 2 мкМ 7ААМД в водном растворе (1), в 100 мкМ растворе гуанина (2) и разностный спектр между ними после нормировки (3).
возбуждения 7ААМД в смеси с гуанином имеется большой вклад от свободных молекул антибиотика, не связавшихся с гуанином. Для того чтобы определить энергию более точно, необходимо использовать разностный спектр (рис. 1), полученный вычитанием спектра возбуждения 7ААМД в воде из спектра возбуждения смеси 7ААМД с гуанином. Для этого сначала проводилось вычита-
ние небольшого вклада светорассеяния гуанина из спектра смеси (в видимой области), затем делалась нормировка в максимуме на спектр свободного 7ААМД в воде и потом бралась разность этих двух спектров. Процедура нормировки позволяет устранить разнонаправленные вклады в интенсивность от снижения коэффициента экстинк-
Таблица 1. Параметры спектра возбуждения 7-аминоактиномицина Д в пуриновых комплексах
Условия* ^max, нм Ни ^diffmax, нм Дv, см 1 Е, ккал/моль
В воде 496 ± 3 105 - - -
+гуанин 533 ± 3 110 565 ± 3 2460 7
+аденин 524 ± 3 110 562 ± 3 2370 6.8
+кофеин 530 ± 3 110 563 ± 3 2400 6.9
+фраг. ДНК 549 ± 3 100 572 ± 3 2680 7.7
* Концентрация 7ААМД — 2 х 10—6 М, гуанина — 1 х 10 4 М, кофеина, аденина и нуклеотидов ДНК — 2 х 10—3 М. Примечание. Хтах — длина волны в максимуме исходного спектра; Н и — полуширина этого спектра; ^йшах — длинноволновый максимум разностного спектра; Av — спектральный сдвиг между максимумом 7ААМД в комплекс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.