m
ВИООП'АИИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 1, с. 70 - 76
УДК 547.953.2'672.7.05 7
ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ЛИПИДНЫЕ ЗОНДЫ С ПЕРИЛЕНИЛЬНОЙ МЕТКОЙ
© 1995 г. И. В. Гречышникова, И. И. Михалев, Юл. Г. Молотковский*
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова РАН, Москва, 117871, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 10.05.94 г.
Описан синтез 4-(3-периленил)бутановой кислоты, а также фосфатидилхолина и сфннгомиелина с остатком этой кислоты. Полученные фосфолипидные флуоресцентные зонды имеют высокий квантовый выход и значительную величину анизотропии флуоресценции в липидном бнслое; предполагается использовать их для изучения мембранных систем.
Ключевые слова: 3-периленильные производные, мембранные зонды, фосфатидилхолин, сфин-гомиелин.
Ранее нами были получены флуоресцентные липиды с 3-перилеиоильным флуорофором [1]. Эти зонды обладают рядом ценных свойств - зна-чи гел н >1м :■ пан гошлм выходом, высоким моляр-ным коэффициентом поглощения; кроме того, положение максимума флуоресценции и ее интенсивность зависят от полярности окружения (периленоильная флуоресценция тушится водой), что позволяет оценивать относительное содержание воды в мембране [2]. Однако последнее свойство делает малоподходящим применение периленоильных зондов в исследованиях, основанных на регистрации анизотропии флуоресценции, поскольку анизотропия периленоильного флуорофора может зависеть не только от его подвижности (для оценки которой и регистрируют, как правило, анизотропию), но и от его доступности для воды (тушение флуоресценции водой предполагает сокращение времени жизни возбужденного состояния, от которого зависит анизотропия).
В то же время регистрация анизотропии флуоресценции - один из наиболее чувствительных методов в изучении мембранных процессов, в частности липид-белковых взаимодействий. Именно этим методом, с применением антрилвинил меченых лини дон, мы получили ряд интересных данных о строении природных мембран и ли-
Оокращении: АРС - 1--ацил-2-[12-(9-антрил)-1 \-транс-цо-дсценоил]-^1-глнцеро-3-фосфохолин, ASM - N-[12-(9-aH-тркл)-11-«/;анс-додеценоил]сфингозин-1-фосфохолин, DMPC - димиристоилфосфатидилхолин, PC - фосфатидилхолин, РегРС - 1-ацил 2-[4-(3-периленил.)бутаноил]-.уя-гли-церо-З-фосфохолин, I'crSM - М-[4-(3-периленил)бутано-|$1сфингозин-1-фосфохолин, РОРС - пальмитоилолеоил-фосфатндилхолин, SM - сфингомиелин бычьего мозга, DOPC - дполеонлфосфатидилхолин. * Autop дли переписки.
попротеинов крови (см., например, обзор [3]). Аптрилвиниловые зонды обладают хорошими флуоресцентными характеристиками - квантовый выход ~0.8 и молярный коэффициент поглощения Е ~ 8000 М"' см"' в полосе возбуждения 368 нм |4]. Но в ряде случаев, например при исследовании мембран, содержащих значительные количества хромопротеидов, желательно иметь зонды с флуорофором, чье возбуждение и испускание прихо дятся на более длинноволновую область спектра.
Все это делает актуальным поиск и применение альтернативных флуорофоров для введения в лигшд-специфические зонды (т.е. зонды, несущие метку в полярной области и близкие по свойствам исходным липидам [3]). Такой флуорофор, как следует из сказанного выше, кроме нечувствительности к полярности окружения и хорошей химической фотоустойчивости, должен обладать высоким молярным коэффициентом поглощения при \>400 нм и значительной анизотропией флуоресценции в вязких средах.
Эти соображения побудили пас синтезировать флуоресцентные фосфолипидные зонды, имеющие в гидрофобной области периленильный остаток, Мы провели синтез 4-(3-периленил)бута-новой кислоты (Ш) и на ее основе - меченых фосфатидилхолина РегРС (VI) и сфннгомиелина PerSM (VII) (схема). Короткий ацильный остаток, на конце которого располагается флуорофор (общая длина меченой кислоты соответствует примерно жирной кислоте С12) был выбран с тем, чтобы флуорофор. находясь в гидрофобной области бислоя, в то же время располагался ближе к полярным головкам, т.е. в той зоне, где, как мы полагаем, флуоресцентные зонды должны быть
РегН РегСО(СН2)2СООН
(I) (П)
RCOOCH2
I
HOCH о
1 II
CH2OPOCH2CH2NMe3
l
CT
(IV)
о
II
CH3(CH2)12CH=CHCHCHCH2OPOCH2CH2NMe3
HO NH2 О
(V)
Per(CH2)3COOH (III) I-
RCOOCH,
l "
Per(CH2)1COOCH О
О
CH3(CH2)l2CH=CHCHCHCH2OPOCH2CH2NMe3 CH2OPOCH2CH2KMe3 HO NH О
(VI) ^ Per(CH2)3CO (уп)
R - CI5H31 : C17H35, 5 : 2
а, ClOCCH2CH2COCI/AlCI3 безводн.
б, H2NNH2/KOH Per
в, DCC/4-диметиламинопиридин
Схема 1.
более чувствительны к влиянию мембранных белков, чем в средней области бислоя.
Кислота (III) была получена восстановлением по Хуан-Минлону 3-(3-периленоил)пропановой кислоты (II), свою очередь синтезированной по описанному методу [5] реакцией перилена (I) с сукциноилдихлоридом по Фриделю-Крафтсу. 4-(3-Периленил)бутановая кислота была синтезирована ранее по той же схеме в МХТИ им. Д.И. Менделеева, однако синтез этот опубликован в малодоступном источнике [6].
Кетокислоте (II) Цинке и др. [5] химическими методами приписали указанное на схеме строение, где боковая цепь занимает положение 3, не рассматривая возможности присутствия других изомеров. По нашим данным, это вещество, как и 4-(3-периленил)бутановая кислота (III), имеет примеси близкородственного соединения, по-пи-димому изомера присоединения цепи к перилено-волгу ядру (в положение 1 или 2), который не отличается от основного вещества по поведению при ТСХ (оба образуют при ТСХ в нескольких системах узкие полосы) и при ВЭЖХ на силикагеле. Однако метиловые эфиры изомеров положения кислот (П) и (III) разделяются при ВЭЖХ на обращенной фазе С)8 при 40°С (см. "Экспериментальную часть"), при этом соотношение основного ве-
щества и изомера в обоих случаях составляет ~9: 1. Спектры флуоресценции обоих изомеров кислоты (III), выделенных в микроколичествах, очень близки (см. ниже). Разделить их кристаллизацией не удалось, препаративное же разделение с помощью ВЭЖХ было бы весьма трудоемким и дорогостоящим.
Для дальнейшего получения меченых фосфо-липидов РегРС и PerSM мы применяли кислоту (III) с примесью изомера, что, по нашему мнению, не должно повлиять на ценность синтезированных зондов как инструментов для мембранных исследований. Действительно, флуоресцентные свойства их (спектр испускания, анизотропия флуоресценции и др.) представляют собой сумму свойств изомеров (с учетом доли каждого). Дать неадекватные результаты в мембранных исследованиях изомерные зонды могут лишь в том случае, если в двух (или нескольких) изучаемых системах компоненты этих систем будут избирательно взаимодейс твовать с изомерами, составляющими зонд. Это едва ли возможно, учитывая чрезвычайную близость физических свойств изомерных флуорофоров: наблюдать разделение изомеров кислот (II) и (III) на два пика удалось лишь при ВЭЖХ на обращенной фазе их метиловых эфиров в тщательно подобранных условиях.
I
I
<
Г*
.....! I
-1---1__1---------1_
300 400 500 600
НМ
Рис. 1. Нормализованные спектры зонда РегРС в изо-ттропанолс: I - возбуждения , 485 им), 2 - испускания (Ласй5 420 им). Концентрация зонда 0.5 мкМ, тем-перат ура ¿0 С
!
--------I------1______|_
300 400 500 600
нм
Рис. 2. Нормализованные спектры возбуждения (/,.?) и испусканий (2, 4) (сдвинуты яо оси ординат) метил-4-(3-периленил)бутаноата и «го изомера в многослойных лииосомах из яичного РСпри 20°С. 1,2 -спектры основного изомера, 3,4 — минорного. Стрелки указывают положение максимумов спектров метил-4-(3-пе-рилеиил)бутаноата в вице неразделенной смеси изо мерой (¡3 тех же условиях).
Фосфолипидные зонды РегРС (VI) и PerSM (VII) были синтезированы по стандартным методикам -ацилированием лизофосфатидилхолина (IV) и сфингозин-1 -фосфохолина (V) соответственно перилепильной кислотой (III) в присутствии DCC и 4-диметиламинопирицина.
По флуоресцентным свойствам перилениль-ные зонды гораздо ближе перилену [7], чем пери-леноильные зонды на основе кислоты (II) [1]. Спектры возбуждения и испускания зонда РегРС в изо пропан оле (рис. 1) практически полностью повторяют соответствующие спектры пери лена |7j со сдвигом на 9-10 нм в длинноволновую область: перилен имеет максимумы при 439, 466 и 497, а РегРС - при 448, 476 и 506 нм."
Спектры как возбуждения (У,.?) (рис. 2), так и испускания (2, 4) обоих изомеров метилового эфира 4-(3-периленил)бутановой кислоты (III) практически полностью совпадают по форме, но максимумы минорного изомера сдвинуты на 8 - 10 нм по сравнению с для основного. Положения максимумов для метилового эфира кислоты (III) (смесь изомеров), указанные стрелками, как и следовало ожидать, близки максимумам основного изомера.
Известно, что положение максимумов флуоресценции и характер спектров флуорофоров, не содержащих полярных групп, мало зависит от характеристик среды, в частности от полярности. Периленильные соединения также полностью сохраняют форму спектра во всех изученных средах; при переходе от малополярного растворителя (гексан) к полярному (метанол) максимумы испускания сдвигаются всего на 2 - 3 нм (табл, 1). Однако в липосомах из яичного фосфат иди л-холина сдвиг максимумов в длинноволновую область несколько больше, хотя усредненная полярность гидрофобной области бислоя. если судить по константе диэлектрической проницаемости, невелика и соответствует проницаемости для растворителей малой полярности, например, диоксана [8| (по глубине бислоя существует градиент полярности, обусловленный степенью проникновения в мембрану воды [9]). Причиной наблюдаемого для липосом увеличенного сдвига, возможно, является влияние анизотропии бислоя на значительный по размерам иериленильньш флуорофор, различные части которого находятся в зонах мембраны с разной полярностью и плотностью упаковки.
Высокий квантовый выход пери лени льно го флуорофора (0.81 в н-бутаноле), близкий квантовому выходу периленоильных зондов (0,65 в гекса-не), вместе с высоким молярным коэффициентом поглощения в полосе возбуждения (£ 39000 М-1 см"' при 414 нм) обуславливает значительную "чувствительность флуоресценции" пер и л ен ильных, Зондов и. следовательно, возможность вводить
минимальное количество зонда в исследуемую систему
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.