МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 5, с. 760-769
ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА
УДК 577.2:547.75
ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МЕТКИ ИНФРАКРАСНОГО ДИАПАЗОНА ДЛЯ АНАЛИЗА ДНК С ПОМОЩЬЮ БИОЛОГИЧЕСКИХ МИКРОЧИПОВ
© 2015 г. М. А. Спицын1, В. Е. Шершов1, В. Е. Кузнецова1, В. Е. Барский2, Е. Е. Егоров1, М. А. Емельянова1, Э. Я. Крейндлин1, Ю. П. Лысов1, Т. О. Гусейнов1, Д. Е. Фесенко1, С. А. Лапа1, С. А. Суржиков1, И. С. Абрамов1, Т. В. Наседкина1, А. С. Заседателев1, А. В. Чудинов1*
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, 119991 2Общество с ограниченной ответственностью "БИОЧИП-ИМБ", Москва, 117312 Поступила в редакцию 28.11.2014 г. Принята к печати 06.02.2015 г.
Для расширения возможностей молекулярно-генетических исследований синтезированы индотрикар-боцианиновые красители, флуоресцирующие в ближней инфракрасной (ИК) области. Свойства синтезированных ИК-красителей изучены с использованием тест-системы для анализа мутаций в генах BRCA1/BRCA2 и CHEK2. Введение флуоресцентной метки в анализируемую ДНК-мишень проводили в ходе ПЦР с праймерами, меченными синтезированными ИК-красителями. Сконструирован анализатор, предназначенный для регистрации и обработки изображений биологических микрочипов (биочипов) в свете их флуоресценции в ИК-диапазоне. Применение синтезированных красителей позволяет проводить анализы в ИК-спектральной области с низкой интенсивностью флуоресценции компонентов исследуемого объекта, подложки, реагентов для проведения анализа, что существенно повышает надежность медико-диагностических анализов.
Ключевые слова: биочипы, анализаторы биочипов, флуорохромы инфракрасного диапазона, молеку-лярно-генетический анализ, мутации.
INFRARED FLUORESCENT MARKERS FOR DNA ANALYSIS ON BIOLOGICAL MICROCHIP, by M. A. Spitsyn1, V. E. Shershov1, V. E. Kuznetsova1, V. E. Barsky2, E. E. Egorov1, M. A. Emelyanova , E. Ya. Kreindlin1, Yu. P. Lysov1, T. O. Guseinov1, D. E. Fesenko1, S. A. Lapa1, S. A. Surzhikov1, I. S. Abramov1, T. V. Nasedkina1, A. S. Zasedatelev1, A. V. Chudinov1 (1Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991; E-mail: chud@eimb.ru; 2Biochip-EIMB, Moscow, 117312). To expand the informational capabilities of molecular-genetic research on the biological microchips, new indotricar-bocyanine dyes that fluoresce in the near infra red (IR) spectral region have been synthesized. The developed IR-dyes were studied using a biochip based test system for detection of mutations in the BRCA1/BRCA2 and CHECK2 genes associated with mammal cancer. The fluorescent label was introduced in the analyzed DNA during PCR process using primers labeled with the synthesized IR dyes. Specialized biochip analyzer that allows to capture and process images of fluorescent biochips in the IR spectral region was designed and manufactured. It has been shown that the use of these dyes make it possible to conduct analysis in the IR region, and improve the reliability of medical diagnostic tests due to low fluorescence intensity of sample components as well as of biochip substrate and the reagents used for analysis.
Keywords: biological microchips, biochip analyzer, IR fluorescent dyes, molecular-genetics analysis, mutations. DOI: 10.7868/S002689841505016X
ВВЕДЕНИЕ
В клинико-диагностических исследованиях, использующих молекулярно-биологические методы, все больший вес приобретают методы анализа полиморфизма последовательностей нуклеиновых кислот, в том числе с помощью биочипов.
* Эл. почта: chud@eimb.ru
Биочипы позволяют с высокой надежностью проводить одновременное исследование десятков и сотен разных участков ДНК [1, 2]. Обнаружение полиморфизма ДНК с помощью тест-систем, использующих биочипы, включает: (1) амплификацию исследуемых участков ДНК анализируемого образца с одновременным введением флуоресцентной метки; (2) гибридизацию амплифициро-
ванного продукта с олигонуклеотидными зондами, иммобилизованными в ячейках биочипа; и (3) регистрацию изображения биочипа в свете его флуоресценции с последующей обработкой изображения.
При регистрации результатов, получаемых с помощью биочипов, их достоверность в значительной степени определяется химическими и физическими свойствами используемых флуоресцирующих красителей: влиянием красителя на эффективность амплификации, молярным коэффициентом экс-тинкции, квантовым выходом флуоресценции, неспецифическим связыванием с различными компонентами биочипа и др. Кроме того, существенное влияние на результаты оказывает наличие в анализируемом образце и в реагентах, применяемых для проведения анализа, а также в материале подложки, веществ, флуоресцирующих при возбуждении применяемого красителя. Именно поэтому в литературе постоянно появляется описание новых методик, в которых используются уже известные или вновь синтезированные красители, флуоресцирующие в разных областях спектра. Это позволяет расширить диапазон диагностических методов и повысить их достоверность.
Известно, что применение красителей, флуоресцирующих при возбуждении в красной области спектра, позволяет повысить чувствительность анализов по сравнению с анализами, проводящимися с помощью красителей, флуоресцирующих при возбуждении в синей или зеленой областях спектра, за счет уменьшения интенсивности флуоресценции компонентов исследуемого объекта, подложки, реагентов для проведения анализа [3, 4]. В настоящее время в качестве флуоресцентных меток в молекулярно-биологических исследованиях, включая исследования, проводимые с помощью биочипов, широко используют красители, флуоресцирующие в красной области спектра (максимум длины волны возбуждения около 650 нм, максимум длины волны флуоресценции около 670 нм) [5—7]. Переход к красителям, флуоресцирующим в ближней ИК-области спектра, позволяет повысить надежность регистрации флуоресценции применяемого ИК-красителя на фоне флуоресцирующих примесей [8, 9]. Применение современных высокочувствительных и надежных способов регистрации результатов биологического анализа методом флуоресцентного маркирования ДНК требует тщательного анализа при выборе химических соединений, предназначенных для этих целей. Индоцианиновые красители позволяют варьировать спектральные характеристики и физико-химические свойства путем изменения их химического строения. В данной работе осуществлен синтез реакционно-способных индотрикарбоцианиновых красителей, различающихся заместителями в индолениниевых фрагментах и полиметиновой цепи.
В представленной работе описана методика получения индоцианиновых ИК-красителей, прибор для получения и обработки изображения биочипов, флуоресцирующих в ИК-области, а также показана возможность использования ИК-красителей для анализа мутаций в геноме человека с использованием технологии гидрогелевых биочипов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использованы реактивы и растворители производства "Sigma", "Aldrich" и "Fluka". Индивидуальность полученных соединений и ход реакции контролировали методом ТСХ на пластинках "RP-18" ("Merck", Германия) и Silufol UV—254 ("Kavalier", Чехия). Колоночную хроматографию проводили на сорбенте Lichroprep RP-18 с размером частиц 0.040—0.063 нм ("Merck", Германия). Детектировали соединения при помощи УФ-лампы при длинах волн 254, 302 и 365 нм (UVLMS-38 EL Series 3UV Lamp; "UVP", США).
1H ЯМР спектры регистрировали на спектрометре Bruker AMX-400 (400 MHz) в растворе DMSO-d6. Химические сдвиги 8 выражены в ppm.
Масс-спектры получали в линейном режиме с регистрацией положительных ионов и при использовании гентистика (2,5-дигидроксибензой-ная кислота) в качестве матрицы на масс-спектрометре MALDI-TOF (Bruker Daltonics Flex Analysis).
Праймеры с ИК-флуоресцентной меткой, предназначенные для проведения ПЦР, получали, как описано ранее [10, 11]. Изготовление биочипов и гибридизацию на биочипах проводили также по ранее описанным методикам [10].
СИНТЕЗ ИК-КРАСИТЕЛЕЙ
Натриевая соль 1-(5-карбоксипентил)-3,3,3',3'-тетраметил-5,5 '-дисульфо-1 '-этилиндотрикар-боцианинового красителя (4). Смесь 2,3,3-триме-тил-5-сульфо-1-этилиндолениния (1) (54 мг, 0.2ммоль), гидрохлорида дифенилимина глута-конового альдегида (2) (71 мг, 0.25 ммоль), уксусного ангидрида (1 мл) и уксусной кислоты (0.2 мл) нагревали 3 ч при 118°С. Далее в реакционную массу добавляли 1-(5-карбоксипентил)-2,3,3-три-метил-5-сульфоиндолениний (3) (106 мг, 0.3 ммоль), уксусный ангидрид (2 мл), уксусную кислоту (1 мл), ацетат калия (118 мг, 1.2 ммоль) и нагревали при 75°С в течение 5 ч. Растворители удаляли, и целевое соединение выделяли обращенно-фазовой хроматографией на колонке RP-18 в системе ацетонит-рил—0.1 М триэтиламмонийацетатный (TEAA) буферный раствор градиентным элюированием от 0 до 50% ацетонитрила. Растворители удаляли, а остаток разбавляли водой, вновь наносили на колонку RP-18, промывали 0.1 М раствором NaCl,
водой, затем выделяли в системе вода-ацетонит-рил градиентным элюированием от 0 до 50% аце-тонитрила. Растворитель удаляли в вакууме, остаток сушили в вакуум-эксикаторе над P2O5.
Получали 30 мг (21%) красителя (4). (Ме-
ОН) = 748 нм, ¡СГ (МеОН) = 767 нм. Найдено:
m/z 681.4 [М]+. C35H41N2O8S-. Вычислено: М = = 681.84. ЯМР 1H (DMSO-d6, 8, м.д., //Гц): 1.27 (т, 3H, CH2CH3, / = 7.0); 1.38, 1.54, 1.72, 2.16 (4м, 8H, СН2СН2СН2СН2СН2СООН); 1.63 [с, 12H, C(3,3)H3, C(3',3')H3]; 4.11 (м, 4H, CH2CH3, СН2СН2СН2СН2СН2СООН); 6.35 (д, 2H, a,a'-CH, / = 13.5); 6.57 (м, 2H, y,y'-CH); 7.28, 7.63, 7.74 (3м, 6H, АгН); 7.74 (м, 1H, 8-CH); 7.88 (м, 2H, ß,ß'-CH).
Натриевая соль 1-(7-аза-12-карбокси-6-кето-додецил)-3,3,3 ',3 '-тетраметил-5,5 '-дисульфо-1'-этилиндотрикарбоцианинового красителя (5).
Смесь натриевой соли 1-(5-карбоксипентил)-3,3,3',3' -тетраметил-5,5' -дисульфо-1' -этилиндотри-карбоцианинового красителя (4) (21 мг, 0.03 ммоль), ^-нитрофенола (pNp) (21 мг, 0.15 ммоль),
0-бензтриазолил-^^^^-тетраметилмочевина-гексафторфосфата (HBTU) (28 мг, 0.075 ммоль) растворяли в диметилформамиде (DMF) (1.5 мл) и перемешивали 3 ч при комнатной температуре, затем реакционную массу охлаждали до —18°C и при перемешивании добавляли в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.