БИОЛОГИЯМОРЯ, 2015, том 41, № 2, с. 122-129
УДК 576.08; 591.11.7;612.017 БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ РЕАКЦИЙ IN VITRO ФАГОЦИТОЗА КАК ЭФФЕКТИВНЫЙ МЕТОД ОЦЕНКИ
АКТИВНОСТИ ГЕМОЦИТОВ ДВУСТВОРЧАТОГО МОЛЛЮСКА MODIOLUS KURILENSIS (BERNARD, 1983) ИЗ ФОНОВЫХ И ИМПАКТНОЙ АКВАТОРИЙ1
© 2015 г. Ю. Н. Сокольникова1, Е. В. Трубецкая1, И. А. Беленёва2, А. В. Гринченко1, В. В. Кумейко1'2
'Дальневосточный федералъныйуниеерситет, Владивосток 690950; 2Институт биологии моря им.А.В.ЖирмунскогоДВО РАН, Владивосток 690041 e-mail: vkumeiko@yandex.ru e-mail:yulia.sn@mail.ru
Статьяпринятакпечати27.11.2014 г.
Флуоресцентный анализ реакций in vitro фагоцитоза гемоцитов моллюсков Modiolus kurilensis из условно фоновых акваторий Японского моря (б. Киевка, зал. Восток, б. Троицы) показал, что средние значения фагоцитарной активности (ФА) и фагоцитарного индекса (ФИ) достоверно не различаются, за исключением ФИ особей из б. Троицы, которые характеризовались незначительным достоверным снижением данного показателя. Среднее значение ФА гемоцитов для всей совокупности животных из условно фоновых акваторий составило 52.0 ± 2.8%. На основе межгодовой оценки ФА гемоцитов популяция животных из зал. Восток была выбрана в качестве основной референсной группы с относительно стабильным уровнем ФА. Модиолусы из импактной акватории (Амурский залив) по сравнению с животными из референсной группы и других исследованных выборок имели достоверно более низкие значения средних ФА (36.0 ± 3.2%) и ФИ (2.1 ± 0.1). Показано, что данный вариант анализа активности клеточного иммунитета двустворчатых моллюсков может служить эффективным способом оценки их физиологического состояния в природе и аквакультуре, поскольку дифференцирует животных из фоновых и импактных акваторий.
Ключевые слова: врожденный иммунитет, фагоцитоз, двустворчатые моллюски, загрязненные и незагрязненные акватории, гемолимфа.
Fluorescent in vitro phagocytosis assay differentiates hemocyte activity of the bivalve molluscs Modiolus kurilensis (Bernard, 1983) inhabiting impacted and non-impacted water areas. Yu. N. Sokolnikova1, E. V. Trubetskaya1, I. A. Beleneva2,A. V. Grinchenko1, V. И ^игаеЛо1-2 (Tar Eastern Federal University, Vladivostok 690950; 2A.V. Zhirmunsky Institute ofMarine Biology, Far East Branch, Russian Academy ofSciences, Vladivostok 690041)
In -vitro hemocyte phagocytosis assay revealed no significant differences in the average values of phagocytic activity (PA) and phagocytic index (PI) in samples of the molluscs Modiolus kurilensis inhabiting non-impacted water areas (Kievka, Vostok, and Troitsa bays, the Sea of Japan). The only exception was an insignificantly lower value of PI for individuals from Troitsa Bay. The average values of PA for hemocytes of the total population of bivalves from non-impacted water areas were 52.0 ± 1.0%. On the basis of the interannual analysis of PA, the bivalve population from Vostok Bay was chosen as an appropriate reference group characterized by relatively stable PA values. In comparison with molluscs from reference group and other investigated samples,.M kurilensis from the impacted water area (Sportivnaya Gavan, Amursky Bay) had considerably lower values of average PA (36.0 ± 2.0%) and PI (2.1 ± 0.05). The presented cell-mediated immunity assay can serve as an effective method for estimation of bivalve physiological state in natural and aquacultural populations in order to differentiate molluscs from impacted and non-impacted water areas. (Biologiya Morya, 2015, vol. 41, no. 2, pp. 122-129).
Keywords: innate immunity, phagocytosis, bivalve molluscs, polluted and non-polluted water, hemolymph.
Активное развитие аквакультуры и биомониторинговых исследований двустворчатых моллюсков привело к необходимости поиска и разработки простых и эффективных методов оценки их физиологического состояния. У моллюсков центральной системой, отвечающей за формирование физиологических адаптаций к измене-
ниям в окружающей среде, за поддержание гомеостаза и обеспечение иммунной защиты, является транспортно-защитная разновидность тканей внутренней среды - гемолимфа. Поэтому показатели активности клеточных факторов иммунитета моллюсков могут быть объективными диагностическими критериями их физиологиче-
1 Работа выполнена при поддержке программы "Научный фонд" ДВФУ и гранта Правительства Российской Федерации для государственной
поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования (№ 11.G34.31.0010).
ского состояния. При этом фагоцитоз как фундаментальная составляющая защитной функции организма может служить одним из основных параметров оценки иммунного статуса. Результаты изучения физиологического состояния морских организмов под влиянием тех или иных факторов, в том числе антропогенного происхождения, обобщены в работе Мидларца с соавторами (Mydlarz et al., 2006). Показано, что разные виды загрязнений оказывали негативное действие на организм, угнетая и истощая его защитные функции (Cheng, 1990; Coles et al., 1995; Pipe, Coles, 1995; Pipe et al., 1999; Dyrynda et al., 2000; Gagnaire et al., 2007; Canesi et al., 2008), однако в редких случаях наблюдалась обратная реакция иммунного ответа (Bouilly et al., 2006). При этом низкий уровень загрязнения, как правило, производил иммуностимулирующий эффект (Cheng, 1990; Coles et al., 1995; Pipe, Coles, 1995; Pipe et al., 1999), а высокие концентрации оказывали подавляющее действие (Coles et al., 1995; Pipe, Coles, 1995; Pipe et al., 1999; Gomez-Mendikute, Cajaraville, 2003). Следует отметить, что эксперименты, как правило, проводятся в основном при краткосрочной экспозиции в искусственно моделируемых условиях загрязнения, что не всегда показывает истинную картину иммунной реакции организма, соответствующую таковой в естественных условиях обитания природным популяциям. При этом работ, посвященных исследованию активности клеточных факторов иммунитета двустворчатых моллюсков из акваторий с различной степенью антропогенной нагрузки, немного (Cajaraville et al., 1996; Dyrynda et al., 2000; Akaishi et al., 2007; Coray et al., 2007; Kolyuchkina, Ismailov, 2007; Giron-Perez, 2010; Gillis, 2012), а для российской части Японского моря они и вовсе отсутствуют. Несмотря на изученность морфофунк-циональных параметров гемолимфы таких митилид, как Mytilus edulis (Wootton et al., 2002; Mayrand et al., 2005; Akaishi et al., 2007; Coray et al., 2007), M. galloprovincialis (Ratcliffe et al., 1985), M. trossulus (Coray et al., 2007) и Perna perna (Barracco et al., 1999), аналогичные данные для представителей широко распространенного рода Modiolus в литературе весьма ограничены (Tunkijjanukij, Olafsen, 1998; Анисимова, 2012). Поэтому цель данной работы состояла в выявлении естественной вариативности показателей фагоцитоза как основного механизма клеточного иммунитета моллюсков у особей Modiolus kurilensis из фоновых и импактной акваторий Японского моря.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Сбор материала. Исследования иммунного статуса проводили на половозрелых особях двустворчатого моллюска Modiolus kurilensis с длиной раковины 65-100 мм, собранных в зал. Петра Великого и в б. Киевка Японского моря. Животные в соответствии с пиком их физиологической активности (Колотухина, Семенихина, 1998) были выловлены в мае-июне 2006 г. в условно фоновых акваториях (не подверженных непосредственному влиянию человеческой деятельности, находящихся под влиянием местных природных
источников): б. Троицы, зал. Восток и б. Киевка (по 28 экз. в каждой акватории). В данных районах хозяйственная деятельность человека незначительна, геохимические условия и содержание поллютантов в воде и грунте соответствуют условно фоновому уровню (Наумов, 2006; Галышева и др., 2008; Журавель и др., 2012). В июне 2009 г. моллюски были собраны в зал. Восток и в импактной акватории Амурского залива, расположенной возле точечного источника эмиссии поллютантов и подверженной действию локальной токсической нагрузки от этого источника, - в Спортивной Гавани (по 30 экз.), в июне 2010 и 2011 гг. - в зал. Восток (по 30 экз.). Согласно физико-химическому мониторингу акваторий Дальнего Востока, Спортивная Гавань, расположенная в черте г. Владивостока, не отвечает санитарно-эпидемиологическим нормам и естественным показателям среды по фенолам, нефтепродуктам, численности патогенных бактерий, в частности энтерококков, концентрации кислорода, фосфора, тяжелых металлов, а также ряду других параметров, которые в разные годы существенно варьируют (Наумов, 2006; Нигматулина, 2007; Коршенко и др., 2010; Маркина и др., 2011). Животные были использованы в эксперименте в день их вылова.
Взятие и обработка гемолимфы. Для оценки активности клеточного иммунитета определяли два показателя фагоцитоза: фагоцитарную активность (ФА) - долю фагоцитирующих гемоцитов и фагоцитарный индекс (ФИ) - среднее число бактерий, поглощенных одним активным фагоцитом. Для этой цели 300 мкл гемолимфы, взятой у каждого животного из ге-мального синуса заднего мускула-аддуктора, центрифугировали в течение 12 мин при 800 g в рефрижераторной центрифуге при температуре 15°С с последующей отмывкой физиологической бескальциевой солевой средой (ФБСС) следующего состава: 436 мМ NaCl, 10 mMKCI, 22 MMNa2HP04-7H20, 16 мМ глюкоза, 12 мМ М-(2-гидроксиэтил)пиперазин-№-2-этансуль-фокислота (HEPES), содержащей 0.45 M этилендиаминтет-рауксусной кислоты (ЭДТА). Для получения первичной клеточной культуры клетки вновь центрифугировали при тех же условиях и ресуспендировали в 300 мкл искусственной солевой среды (ИСС) с осмотичностью 1090 м Осм, содержащей 460 мМ NaCl, 9.4 мМ KCl, 48.3 мМ MgCl2-6H20, 6 мМ NaHCOj, Ю.8мМСаС12-2Н2Ои 10 mMHEPES. Для постановки реакции фагоцитоза суспензию от каждого животного, содержащую 10-15 тыс. гемоцитов, помещали на предметные стекла. Образцы инкубировали во влажной камере при температуре 17°С в течение 40 мин для максимальной адгезии клеток к субстрату.
Приготовление бактериальной суспензии. В качестве
био
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.