БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 6, с. 480-487
УДК 577.336
ФЛУОРИМЕТРИЧЕСКОЕ СРАВНЕНИЕ ПРОТОМИТОХОНДРИЙ
И МИТОХОНДРИЙ
© 2008 г. А. Н. Зинина, Н. Л. Векшин
Институт биофизики клетки РАН, 142290, Пущино Московской области; электронная почта: nvekshin@rambler.ru Поступила в редакцию 02.06.2008 г.
Из клеток печени крысы с помощью центрифугирования и фильтрации через миллипоровые фильтры с размером пор от 0.1 до 0.45 мкм выделены и флуориметрически охарактеризованы внутриклеточные митохондриальные зародышевые органеллы - протомитохондрии (ПРМ), являющиеся в специализированных клетках животных предшественниками митохондрий. Имея объем в десятки раз меньший, чем легкие митохондрии (ЛМ), ПРМ не сильно отличаются от них по составу белков, липидов, ДНК, поверхностному заряду и другим параметрам. При этом активность некоторых ферментов дыхательной цепи (NADH-дегидрогеназа, сукцинат-дегидрогеназа) у ПРМ даже выше, чем у ЛМ. Полученные данные важны для понимания процессов митохондриогенеза в специализированных клетках млекопитающих.
Как известно, митохондриальные органеллы гетерогенны по размерам, морфологии [1, 2] и плотности [3, 4]. Они участвуют в онтогенезе клетки и ее старении [5]. Митохондрии разного размера - это органеллы на разных стадиях жизненного цикла [1, 4, 6, 7]. В специализированных клетках млекопитающих одновременно присутствуют как минимум три популяции митохондриальных орга-нелл: "молодые" - диаметром менее 1 мкм, "зрелые" - примерно 1-2 мкм и "старые"— крупнее 2 мкм, причем-, соотношение популяций зависит от вида клеток и их возраста [1].
Молодые митохондрии в специализированных клетках животных возникают обычно не путем деления пополам (как в делящихся неспециализированных клетках), а из мельчайших зародышевых протомитохондрий (ПРМ) [1, 8], названных так [8] по аналогии с дрожжевыми промитохондриями [9, 10]. Вообще термин "промитохондрия" неудачен, так как этим словом называют также гипотетическую органеллу, возникшую в ходе эволюции в результате симбиотического внедрения бактерий в клетки.
Дрожжевые промитохондрии - это органеллы с неразвитыми мембранами и без некоторых цито-хромов [9, 10]. Они впервые были выделены и изучены много лет назад, особенно тщательно - в лаборатории Шатца [10-14]. Как и митохондрии, они содержат кольцевую ДНК. Активность АТР-азы, КАБЫ: феррицианид-редуктазы и сукцинат: фер-рицианид-редуктазы в дрожжевых промитохон-дриях в несколько раз ниже, чем в митохондриях, а КАБЫ-оксидазная, сукцинат-оксидазная и цито-хром-оксидазная активности вообще не обнаруживаются, что говорит о неполной или поврежденной
дыхательной цепи. Промитохондрии дрожжей лишены ряда белков, в частности некоторых цито-хромов. В аэробных условиях промитохондрии дрожжей приобретают способность к синтезу белков и превращению в нормальные митохондрии [13, 14].
В отличие от хорошо изученных дрожжевых промитохондрий, ПРМ животных изучены недостаточно, так как лишь относительно недавно научились их выделять в неповрежденном виде [15]. Установлено, что они обладают обеими полноценными мембранами - наружной и внутренней [15, 16]. Электронно-микроскопические фотографии ПРМ приведены в [16]. ПРМ имеют диаметр 0.10.5 мкм. ПРМ - это самые юные митохондриальные органеллы клеток животных. Постепенно увеличиваясь в размере до 1 мкм, они становятся зрелыми митохондриями [17-20]. Например, в течение нескольких дней развития печени у цыпленка диаметр каждой малой митохондриальной органеллы возрастает в несколько раз [17]. В течение 2 нед роста летательной мышцы саранчи вес (но не количество!) митохондриальных органелл увеличивается в 60 раз. Отмечалось также, что на ранних стадиях развития ооцитов имеются в основном мелкие митохондриальные органеллы диметром 0.2-0.5 мкм [21], которые затем сильно вырастают. Биогенез митохондриальных мембран известен в деталях [22, 23]. Некоторые субъединицы КАБЫ-дегидрогеназы, цитохромоксидазы и АТР-азы кодируются митохондриальной ДНК и синтезируются на митохондриальных рибосомах [24, 25]. Не менее 85% митохондриальных белков кодируется ядерной ДНК [22-26].
ПРМ фиксированного диаметра были впервые получены из клеток сердца и печени млекопитающих с помощью высокоскоростного центрифугирования с последующим фильтрованием разбавленной общей митохондриальной фракции через инертные миллипоровые фильтры с малым диаметром пор [8, 15]. Проведено биохимическое изучение двух фракций ПРМ: диаметром менее 0.45 мкм и менее 0.22 мкм. Показано их сходство с митохондриями по дыханию, содержанию цитохро-мов и флавинов, общему составу белков и соотношению белок/ДНК [15]. При этом обнаружены некоторые отличия (отражающие, вероятно, процесс внутриклеточного превращения ПРМ в зрелые митохондрии) по активности NADH-дегидрогеназы и сукцинат-дегидрогеназы, а также по количественному содержанию как минимум трех белков - 58, 103 и 155 кДа [15], два из которых входят, по-видимому, в состав NADH -дегидроге-назы.
В данной работе продолжено изучение ПРМ, главным образом, с помощью высокочувствительной флуоресцентной спектроскопии. Поскольку выделение ПРМ из сердечной ткани сопряжено с большими механическими нагрузками, приводящими к загрязнению фракции обрывками митохондрий, то всю работу проводили только на фракциях из печени крысы (где митохондриаль-ные органеллы при выделении хорошо сохраняют свою целостность), причем исходно брали не общую, а только "легкую" митохондриальную фракцию.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Легкую митохондриальную фракцию из печени самцов крыс линии Вистар выделяли в среде, содержащей 20 мМ трис-HCl и 300 мМ сахарозы (рН 7.6), при температуре 2°С стандартным методом [27] с модификациями [28], с тем отличием, что центрифугирование исходной общей суспензии проводили при 1000 g в течение 10 мин, в результате чего осаждались (и затем отбрасывались) не только клетки, но и тяжелые митохондрии. Полученный супернатант центрифугировали при 15300 g в течение 20 мин, в результате чего осаждались легкие митохондрии (ЛМ) и ПРМ, а также микросомы. Не менее 50% всех частиц суммарной фракции составляют ПРМ, имеющие размер до 0.45 мкм. Дыхательный контроль суммарной фракции составлял 3.5 (на сукцинате и ADP). Отдельные фракции ПРМ фиксированного размера получали, как описано в [15], фильтрованием разбавленной "легкой" митохондриальной суспензии, разведенной в среде выделения до концентрации белка 1-3 мг/мл, через миллипоровые фильтры "Millex HV" с диаметром пор 0.45, 0.22 и 0.1 мкм или через аналогичные фильтры "Acrodisc HT Tuffryn".
Концентрацию митохондриального белка определяли грубо биуретовым методом и более точно -УФ-экспресс-методом [29]. В суммарной легкой фракции концентрация по белку составляла 30 мг/мл. Размер митохондриальных частиц контролировали с использованием корреляционной микроскопии [30], а также микроскопии в проходящем свете с помощью окрашивания янусом зеленым.
NADH-оксидазную, КАБН:феррицианид-ре-дуктазную и NADH:тетразолий-редуктазную активность фракций ПРМ и ЛМ измеряли (в той же среде) после замораживания-оттаивания, приводящего к появлению проницаемости мембран для NADH. Скорость окисления NADH детектировали фотометрически по убыли его поглощения при 340 нм или по появлению поглощения формазана при 530 нм в ходе восстановения я-нитротетразо-лия фиолетового (пНТФ) [1], а также флуоримет-рически - по снижению флуоресценции NADH (возбуждение 340 нм, излучение 440 нм) [31]. Сук-цинат:тетразолий-редуктазную активность в тех же образцах определяли по появлению поглощения формазана из пНТФ [1].
Флуоресценцию триптофановых остатков белков ПРМ и ЛМ, эндогенных флавинов и добавленного NADH регистрировали на спектрофлуори-метрах "SLM-4800" (SLM, Inc., США) и "Perkin-Elmer MF44" ("Perkin-Elmer", США) в 1 см кварцевых кюветах при 20°С. При измерении времени жизни возбужденного состояния (т) и степени поляризации флуоресценции (P) в ряде опытов, где интенсивность флуоресценции была низкой, использовали зеркальные кюветы, позволяющие усилить сигнал в несколько раз [32].
Спектры поглощения записывали на спектрофотометре "М-40" ( "Zeiss", Германия) в спецотсеке для рассеивающих образцов.
Относительное содержание ДНК/белок определяли двумя способами - по оптической плотности при 260/280 нм после разрушения частиц доде-цилсульфатом натрия (SDS) и по интенсивности флуоресценции триптофановых остатков белков и этидийбромида, встраивающегося в ДНК [32].
В работе использованы флуоресцентные зонды: 1-анилинонафталин-8-сульфонат (АНС, "Merck"), мероцианин-540 ("Sigma"), этидийбро-мид ("Serva"), тетрациклин (х.ч.) и ароматический углеводород пирен ("Koch-Light").
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Мы сравнили флуоресцентные свойства белков и флавобелков фракций ПРМ и ЛМ (табл. 1). С этой целью была измерена их флуоресценция (в интервале 315-410 нм при возбуждении на "красном" краю полосы триптофанового поглощения 300 нм) и их флавиновая флуоресценция (в интер-
Таблица 1. Параметры флуоресценции протомито-хондрий и легких митохондрий
Параметр ПРМ-0.22 ПРМ-0.45 ЛМ
Триптофановая интенсивность, % 100 ± 2 99 ± 2 93 ± 2
Максимум, нм 338 ± 2 338 ± 2 337 ± 2
Полуширина, нм 62 ± 3 60 ± 3 58 ± 3
Время жизни, нс 3.2 ± 0.2 3.4 ± 0.2 3.6 ± 0.2
Степень поляризации 0.21 ± 0.01 0.21 ± 0.01 0.22 ± 0.01
Флавиновая интенсивность, % 91 ± 2 92 ± 2 100 ± 2
Максимум, нм 520 ± 3 522 ± 3 524 ± 3
Полуширина, нм 63 ± 5 64 ± 5 65 ± 5
Время жизни, нс 6.0 ± 0.3 6.2 ± 0.3 6.5 ± 0.3
Степень поляризации 0.36 ± 0.02 0.37 ± 0.02 0.38 ± 0.02
Примечание. Степень поляризации Р триптофановой флуоресценции измерена в условиях возбуждения при 295 нм и излучения при 338 нм, а флавиновой - при возбуждении 450 нм и излучении 525 нм.
вале 500-580 нм при возбуждении в максимуме полосы флавинового поглощения при 450 нм).
Триптофановая флуоресценция. Интенсивность триптофановой флуоресценции ПРМ и ЛМ оказалась почти одинаковой (табл. 1; при выровненных оптических плотностях проб в области 280-300 нм). Следует особо отметить, что при этом концентрация ЛМ по белку, измеренная по биуретовой реакции или по УФ-экспресс-методу в при
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.