ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 414, № 2, с. 259-262
УДК 577.218 + 546.72 + 548.3
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
ФОРМИРОВАНИЕ ДВУНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ ДНК В ЛЕЙКОЦИТАХ КРОВИ МЫШЕЙ ПРИ ОБРАБОТКЕ КЛЕТОК НИТРОЗИЛЬНЫМИ КОМПЛЕКСАМИ ЖЕЛЕЗА
© 2007 г. С. В. Васильева, А. Н. Осипов, Н. А. Санина, академик С. М. Алдошин
Поступило 13.12.2006 г.
Метод ДНК-комет (Comet Assay ) использован для количественного определения двунитевых разрывов ДНК (ДР ДНК) в лейкоцитах крови млекопитающих, индуцированных нитрозильными комплексами железа. Впервые изучены кристаллические тетранитрозильные комплексы железа (ТНКЖ) с тиосульфатом (ТНКЖтио) и тетразолом (ТНКЖтетразо). Выявлена линейная зависимость между их концентрацией в растворах и уровнем ДР ДНК. ТНКЖтио индуцировал больше ДР ДНК на единицу дозы в сравнении с ТНКЖтетразо, но относительное количество низкомолекулярных фрагментов ДНК было выше в опытах с ТНКЖтетразо. При этом во взаимодействие с клеточными структурами могут вступать и донируемый NO, и различные интермедиаты, в том числе кислородсодержащие NOS, и ДНКЖ, формирующиеся в процессе гидролиза в аэробных условиях. Индукция (нерепарируемых) ДР ДНК является главным механизмом противоопухолевой активности у изученных нитрозильных комплексов железа, поскольку именно ДР ДНК клеток млекопитающих выполняют функции "сигнальных структур" -предшественников развития гибели клеток.
Наличие позитивной корреляции между ростом объема NO, выделяемого макрофагами при воспалительных явлениях, и развитием различных форм рака у человека привело к установлению взаимосвязи канцерогенной активности NO и индукции повреждений ДНК [1]. Хотя NO, по-видимому, прямо не взаимодействует с ДНК, в аэробных условиях он превращается в реакцион-носпособные соединения (ROS), главным из которых является пероксинитрит ONOO-. ONOO- преимущественно окисляет гуанин в 7,8-дигидро-8-
Институт биохимической физики Российской Академии наук, Москва Институт общей генетики им. НИ. Вавилова Российской Академии наук, Москва Институт проблем химической физики Российской Академии наук, Черноголовка Московской обл.
оксигуанин, с последующей деградацией до 8-ок-сигуанина и 8-нитрогуанина [2]. 8-оксигуанин есть потенциально мутагенное повреждение, вызывающее трансверсии ГЦ ^ ТА, а 8-нитрогуа-нин легко подвергается депуринизации, давая потенциально летальные и мутагенные апуриновые и апиримидиновые сайты, при репарации которых возникают разрывы ДНК [3].
Недавно японские ученые идентифицировали новый продукт окисления ДНК-оксанин, образующийся при нитрози(ли)ровании гуанина оксидом азота или азотистой кислотой [4]. Помимо мутагенного и цитотоксического действия, окса-нин способен формировать аддукты или ДНК-белковые сшивки с нуклеофильными клеточными молекулами, например глицином или лизином, эксцизия которых ЦугАБС-нуклеазой приведет к формированию промежуточных одно- и двунитевых разрывов ДНК [4].
В связи с крайне малым периодом жизни для изучения функций и механизмов действия N0 перспективно использование его доноров, в том числе кристаллических ди- и тетранитрозильных комплексов железа [5].
Данные ЭПР-спектроскопии и спектров поглощения водных и ДМСО-растворов ТНКЖ в УФ- и видимом диапазонах [6] свидетельствуют о формировании моноядерных динитрозильных комплексов (ДНКЖ), которые способны проникать через клеточные мембраны [6] и формировать в дальнейшем высокомолекулярные комплексы ДНКЖ -белок в клетках про- и эукариот [7-9]. По-видимому, именно эти комплексы служат сигнальными молекулами в молекулярно-генетических процессах. В публикации 2006 г. [9] ДНКЖтио был охарактеризован как перспективный индуктор апо-птоза в клетках человека.
В настоящей работе впервые изучено формирование двунитевых разрывов ДНК в лейкоцитах крови мышей, обработанных растворами нитрозильных комплексов железа - ТНКЖтио и ТНКЖтетразо. Ранее нами было установлено, что эти комплексы вызывали эффективное тормо-
259
8*
ДНК в хвосте, % 35 г
3025 -2015
10 V
5"
0
(а)
Момент хвоста 16
14
12
10
8
6
4
2
4 6 0
Концентрация, мМ
Рис. 1. Зависимость количества ДР ДНК в лейкоцитах крови мышей (процент ДНК в хвосте ДНК-кометы (а) и момент хвоста (б)) от концентрации ТНКЖтио.
2
2
4
6
жение роста опухолевых клеток человека (линия клеток - рак яичника человека SKOV3) [10].
Кристаллические комплексы ТНКЖтио Na2[Fe2(S2O3)2(NO)4] ■ 4H0 и ТНКЖтетразо синтезировали по методу [5]. Их растворяли в дистиллированной воде, либо в 10% диметилсульфоксида (ДМСО) непосредственно перед экспериментом. Суспензию лейкоцитов периферической крови мышей-самцов линии СВА/lac (1-2) ■ 106 клеток/мл) в фосфатно-солевом буфере (рН 7.4) инкубировали с раствором ТНКЖтио (1 и 5 мМ) или ТНКЖтетразо (5 и 10 мМ) в течение 30 мин при температуре 37°С. Для количественной оценки ДР дНк в лейкоцитах использовали модифицированный метод электрофореза единичных клеток (метод ДНК-комет) в нейтральных условиях [11]. B соответствии с ним количество разрывов ДНК прямо пропорционально количеству мигрировавшей из ядерной области ДНК и расстоянию ее миграции. После проведения электрофореза ДНК иммобилизованных в агарозу и лизированных единичных клеток, 10 мкл суспензии лейкоцитов (1 ■ 106 клеток/мл) в фосфатно-солевом буфере смешивали со 100 мкл 0.5%-ного раствора легкоплавкой агарозы (тип IV) в том же буфере при температуре 37°С, наносили на предварительно покрытые 1%-ным слоем нормоплавкой агарозы предметные стекла. Лизис клеток проводили в течение 2 ч в холодном (4°C) лизирующем буфере, после чего слайды помещали в холодный (4°C) TBE-буфер на 20 мин [11]. Электрофорез проводили в TBE-буфере при напряжении 1.25 B/см и температуре 4°C в течение 20 мин. Слайды слегка подсушивали и фиксировали в 96%-ном этаноле в течение 10 мин. Для окраски ДНК использовали акридиновый оранжевый (2 мкг/мл в фосфатно-соле-вом буфере). Визуализацию ДНК-комет проводили с помощью микроскопа МИКМЕД-2 вар. 11 (ЛО-МО, Россия) и видеосистемы на основе цифровой камеры Nikon Coolpix 4500. Для анализа дНК-ко-
мет использовали программу CometScore (TriTek Corp.). Оценивали момент "хвоста" и процент ДНК в хвосте ДНК-комет. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программы Statistica 6.0. Данные представлены как средние трех независимых экспериментов ± стандартная ошибка. Для оценки достоверности различий использовали ¿-критерий Стьюдента.
Для измерения концентрации NO, генерируемого сера-нитрозильными комплексами железа в растворах, использовали сенсорный электрод "amiNO-700" системы "inNO Nitric Oxide Measuring System" (Innovative Instruments, Inc., Tampa, FL, USA). Концентрацию NO фиксировали в течение ~250 c (с шагом 2 с) в 1%-ном водном растворе ДМСО c концентрацией доноров NO 0.1 мкМ. Для калибровки электрохимического сенсора использовали стандартный водный раствор NaNO2 (100 мкМ), который добавляли в смесь 0.12 М KI (фирмы "Aldrich") и 2 мл 1М H2SO4 (марки хч) в 20 мл воды. Все эксперименты проводили в аэробных условиях при температуре 23°С; pH растворов измеряли с помощью мембранного рН-метра "HI 8314" (HANNA Instruments, Germany).
Результаты экспериментов показали, что инкубация лейкоцитов периферической крови мышей с ТНКЖтио приводит к достоверному линейнозави-симому от концентрации увеличению уровня ДР ДНК, оцененного по проценту ДНК в хвосте ДНК-кометы (рис. 1а) и моменту хвоста (рис. 16).
Сходные линейные дозовые зависимости индукции ДР ДНК были получены и при инкубации лейкоцитов с другим донором оксида азота -ТНКЖтетразо (рис. 2). Основываясь на предварительных данных о сравнительной цитотоксично-сти двух этих доноров, в опытах с ТНКЖтетразо использовали двукратно более высокие концентрации препарата - 5 и 10 мМ. При сравнении угловых коэффициентов, которые в линейных регрессионных уравнениях характеризуют прирост эф-
ФОРМИРОВАНИЕ ДВУНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ ДНК
261
ДНК в хвосте, % 35 г
3025 ■ " 20 15 10--, 5-
0
(а)
Момент хвоста 45 40 35 30 25 20 15 10
5
0
10
Концентрация, мМ
10
Рис. 2. Зависимость количества ДР ДНК в лейкоцитах крови мышей (процент ДНК в хвосте ДНК-кометы (а) и момент хвоста (б), от концентрации ТНКЖтетразо.
5
5
фекта на единицу дозы, показано, что по проценту ДНК в хвосте ДНК-комет угловой коэффициент для ТНКЖтио был выше, чем для ТНКЖтетразо (3.1 и 2.4 соответственно). Однако при сравнении угловых коэффициентов для другого параметра (момент хвоста) ситуация оказалась обратной, угловой коэффициент для ТНКЖтио был ниже, чем для ТНКЖтетразо (2.8 и 3.8 соответственно). Эти противоречия объясняются тем, что при оценке момента хвоста учитывается не только процент ДНК, мигрировавшей из ядерной области, но и расстояние миграции фрагментов ДНК (момент хвоста есть произведение длины хвоста кометы на процент ДНК в хвосте). Таким образом, хотя ТНКЖтио по сравнению с ТНКЖтетразо индуцирует несколько больше ДР ДНК на единицу дозы, относительное количество низкомолекулярных фрагментов ДНК, образующихся в лейкоцитах при инкубации с ТНКЖтио, меньше, чем при инкубации с ТНКЖтетразо. Увеличение степени фрагментации ДНК может объясняться увеличением количества низкомолекулярных фрагментов ДНК, формирующихся при репарации ДНК. Оценка количества N0, генерируемого изученными донорами, приведена в табл. 1. Установлено, что ТНКЖтетразо в аэробных условиях обладает более высокой N0-донирующей активностью, чем ТНКЖтио в тех же условиях, что коррелирует с объемом ДР ДНК, образующихся в лейкоцитах при инкубации с ТНКЖтетразо. Сравнительное масс-спектрометрическое изучение продуктов гидролиза исследуемых доноров в аэробных условиях показало, что выделение N0 в растворах протекает через стадию образования нитрозиль-ных интермедиатов, в частности, динитрозильных моноядерных комплексов железа (ДНКЖтио и ДНКЖтетразо) с соответствующими серусодержащи-ми лигандами [12]. При этом ДНКЖтио оказался более устойчивым, чем ДНКЖтетразо, и донировал N0 пролонгированно. Таким образом влияние на
клеточную ДНК оказывает не только донируемый комплексами NO, но и формирующиеся NOS.
Как правило, при оценке потенциальной
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.