ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия Б, 2007, том 49, № 1, с. 125-129
УДК 541.64:547.96
ФОРМИРОВАНИЕ ФИБРИЛЛ ЛИЗОЦИМА НА ТВЕРДОЙ ПОДЛОЖКЕ В УСЛОВИЯХ, ПРИ КОТОРЫХ ОНИ НЕ ОБРАЗУЮТСЯ В РАСТВОРЕ1
© 2007 г. Е. В. Украинцев*' ***, Г. А. Киселев*' ***, А. А. Кудринский**, Г. В. Лисичкин**, И. В. Яминский*' ***
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова. Физический* и химический** факультеты 119992 Москва, Ленинские горы ***Общество с ограниченной ответственностью "Академия биосенсоров" 119311 Москва, ул. Строителей, 4-5-47 Поступила в редакцию 20.04.2006 г. Принята в печать 24.08.2006 г.
С помощью атомно-силового микроскопа ФемтоСкан™ исследовано формирование фибрилл лизо-цима на твердой подложке. Обнаружено, что при комнатной температуре и рН 3 буферного раствора, т.е. в условиях, при которых агрегация в растворе не происходит, на поверхности может наблюдаться образование фибрилл. Установлено, что близость молекул лизоцима к поверхности графита способствует их агрегации. Физическая сорбция лизоцима на поверхность золота не приводит к его агрегации, а химическая прививка лизоцима к поверхности золота способствует образованию фибрилл. На Атомных весах™ измерена сила взаимодействия молекул лизоцима, иммобилизованных на золотой поверхности кантилевера.
ВВЕДЕНИЕ
Исследование агрегации лизоцима в растворе было проведено несколькими группами ученых [1, 2]. Агрегация молекул лизоцима, как и амилоид-^-пептида, является следствием перехода молекул белка в состояние с неправильной укладкой, который происходит при понижении рН среды [3]. Некоторые заболевания, такие как амилоидозы, синдромы Альцгеймера и Паркинсона, связаны с тем, что молекулы белка, утратившие под влиянием разных факторов нативную трехмерную структуру, собираются в стабильные, упорядоченные, состоящие из волокон агрегаты, называемые амилоидными фибриллами [4]. Для разработки методов предупреждения и лечения таких заболеваний важно установление механизма и факторов, влияющих на взаимодействие между молекулами полипептидов. Цель настоящей работы - изучение влияния рН, типа поверхности и химической прививки на межмолекулярные взаимодействия между молеку-
1 Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта 04-03-32472-а) и Фонда содействия развитию малых предприятий в научно-технической сфере (код проекта 4994).
E-mail: ukraints@polly.phys.msu.ru (Украинцев Егор Владиславович).
лами лизоцима. Показано, что ковалентная прививка лизоцима по использованной в работе методике не препятствует агрегации. Напротив, агрегация иммобилизованного белка протекает быстрее и в более мягких условиях, чем в растворе; физическая сорбция также способствует агрегации.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Иммобилизация лизоцима
Очистку кремниевых кантилеверов fpC01 (Научно-исследовательский институт физических проблем им. Ф.В. Лукина, длина 350 мкм, ширина 35 мкм, k = 0.03 Н/м), с одной стороны покрытых золотом, производили смесью равных объемов концентрированной серной кислоты и 30%-ного водного раствора пероксида водорода.
Для иммобилизации лизоцима из белка куриных яиц на золотой поверхности кантилевер обрабатывали последовательно раствором 4-амино-тиофенола в метаноле (50 ммоль/л) в течение 17 ч, 5%-ным водным раствором глутарового альдегида в течение 2 ч и раствором лизоцима (10 мг/мл) в ацетатном буферном растворе (150 ммоль/л, рН 4.5) в течение 1 ч. Для блокировки непрореагировавших альдегидных групп кан-
Поверхностное натяжение, Н/м
0.04 0
-0.04
-
- 2
3
4
1 "———--7 1 1 1
4 8 12 16
Время, ч
Рис. 1. Временная зависимость поверхностного натяжения пленки лизоцима, находящейся на золотой (7) и кремниевой (2) поверхности кан-тилевера; 3, 4 - результаты соответствующих контрольных экспериментов, в которых кван-тилевер не обрабатывали лизоцимом.
отклонение кантилевера. Поверхностное натяжение пленки рассчитывали по формуле Стони [7]:
Да =
Ей
-Л г,
3 (1- V) I2
где Да - разница сил поверхностного натяжения между верхней плоскостью кантилевера, имеющей специфическое покрытие, и его нижней поверхностью, на которой покрытие отсутствовало; I и d - длина и толщина прямоугольного кантилевера соответственно; V и Е - коэффициент Пуассона и модуль Юнга материала кантилевера соответственно; Дг - величина отклонения кантилевера.
тилевер обрабатывали буферным раствором на основе трис-гидроксиметиламинометана (рН 4.5) в течение 1 ч.
Для иммобилизации лизоцима на кремниевой поверхности кантилевер модифицировали раствором 3-аминопропилсилатрана в воде (167 мкмоль/л) в течение 1 ч [5], а затем растворами глутарового альдегида и лизоцима и трис-гидроксиметилами-нометана, как описано выше.
Иммобилизацию лизоцима на свежесколотой поверхности слюды и на слюде с напыленным на ней золотом проводили аналогично модифицированию кантилевера. Тонкую золотую пленку толщиной ~30 нм напыляли на свежесколотую поверхность слюды при помощи ионного напылите-ля Eiko 1В-3.
Физическую сорбцию лизоцима с концентрацией 1 мг/мл из глицинового буферного раствора с рН 3.0 на свежесколотую поверхность графита, слюды, слюды со слоем 3-аминопропилсилатрана и золота осуществляли в течение 7 дней.
Измерение поверхностного натяжения пленки на поверхности кантилевера
Для определения поверхностного натяжения пленки на поверхности кантилевера использовали устройство Атомные весы™ [6], представляющее собой тефлоновую измерительную ячейку объемом 200 мкл, в которую помещается кантилевер, и оптическую систему, состоящую из лазера и фотодиода; с ее помощью регистрировали
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование поверхностного натяжения пленок лизоцима
Из анализа спектров кругового дихроизма раствора лизоцима известно, что при рН < 3.8 при повышенной температуре нативная структура лизоцима разрушается и молекулы белка переходят в состояние с неправильной укладкой [2]. Поэтому влияние кислотности среды на агрегацию лизоцима было исследовано при значениях рН 3.0 и 4.5, т.е. соответственно выше и ниже рН конформа-ционного перехода белка. Все эксперименты проводили при комнатной температуре.
Кантилевер с иммобилизованным на золотой поверхности лизоцимом был помещен в глициновый буферный раствор (150 ммоль/л, рН 3.0). На рис. 1 показано изменение поверхностного натяжения пленки лизоцима на кантилевере. Целиком процесс изгиба кантилевера в сторону золота при комнатной температуре занял несколько часов. Наблюдаемое явление объясняется тем, что при помещении кантилевера в буферный раствор соседние молекулы белка начинают взаимодействовать друг с другом, поверхностное натяжение пленки увеличивается, и кантилевер изгибается в сторону золотой поверхности, покрытой лизоцимом. Через некоторое время большинство молекул объединяется в агрегаты. После этого процесс изгиба кантилевера происходит медленнее, при этом, по данным атомно-силовой микроскопии, на поверхности кантилевера начинают образовываться фибриллы. В контрольном эксперименте, в котором отсутствовал этап модификации кантилевера раствором лизоцима, было установлено, что кан-
тилевер не изменяет свою форму. Следовательно, деформация кантилевера связана с взаимодействием молекул белка на поверхности.
Из данных по изгибу кантилевера была оценена сила взаимодействия между двумя молекулами лизоцима. Усредненная сила поверхностного натяжения а пленки лизоцима, иммобилизованного на золотой поверхности, равна 0.065 ± 0.010 Н/м. Результирующая сила взаимодействия, приходящаяся на одну молекулу белка и дающая вклад в поверхностное натяжение, составляет = аh = = 195 ± 40 пН. Расстояние между отдельными мономерными звеньями было принято равным высоте отдельного звена, h = 3.0 ± 0.2 нм. При расчете силы взаимодействия двух молекул учитывалось, что при образовании плотнейшего монослоя, состоящего из белковых глобул, каждая молекула взаимодействует с шестью соседними. Из принятой модели гексагональной упаковки следует, что результирующую силу можно разложить по базису сил парных взаимодействий молекул (рис. 2), тогда
=
2СО8 (П/6 )
= 113 ± 24 пН.
Полученная сила значительно меньше, чем сила взаимодействия между покрытыми лизоцимом слюдой и кантилевером при рН 3.0, которая составила 1100 пН [2]. Вероятно, это объясняется тем, что в данных экспериментах было исследовано адгезионное взаимодействие между образцом и кантилевером, которое не связано с взаимодействием между отдельными молекулами белка, так как оно появляется и при отсутствии белка на поверхности [3]. Полученное нами значение силы очень близко к силе (РХ4 = 64 ± 16 пН), которую нужно приложить к агрегату, состоящему из нескольких мономерных звеньев лизоцима Х4, чтобы разорвать связь между 21 и 124 остатками одного звена и увеличить тем самым контурную длину агрегата на 36 ± 5 нм [8].
При помещении кантилевера с лизоцимом, иммобилизованным на золотой поверхности, в ацетатный буферный раствор с рН 4.5 в течение 8 ч изгиба кантилевера не наблюдалось. При этом после замены ацетатного буферного раствора на глициновый с рН 3.0 кантилевер деформировался в сторону золота. Изгиб кантилевера при рН 3.0 и отсутствие изгиба при рН 4.5 согласуется с тем, что при понижении кислотности среды ниже 3.8 в ли-зоциме наблюдается конформационный переход из нативного состояния в состояние с неправиль-
Рис. 2. Модель структуры слоя лизоцима. d -ширина квантилевера. Короткие стрелки - направление сил межмолекулярных взаимодействии, длинная стрелка - направление результирующей силы.
ной укладкой, скорее всего, сопровождающийся увеличением вероятности образования связи между двумя молекулами лизоцима и их агрегацией.
Для изучения влияния способа иммобилизации на агрегацию лизоцима белок был ковалентно закреплен на кремниевой поверхности кантилевера. При помещении такого кантилевера в глициновый буферный раствор с рН 3.0, не содержащий лизоцима, происходил изгиб кантилевера в сторону кремния (рис. 1), а при рН 4.5 изгиба не наблюдалось.
Таким образом, лизоцим, иммобилизованный с помощью глутарового альдегида на различных аминированных поверхностях, агрегирует при комнатной т
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.