УДК 579:222
ФОРМИРОВАНИЕ ГИДРОКСИЛИРОВАННЫХ СТЕРОИДНЫХ ЛАКТОНОВ ИЗ ДЕГИДРОЭПИАНДРОСТЕРОНА КУЛЬТУРОЙ
8р1саг1а /итоБо-гоБва F-881
© 2015 г. Т. Г. Лобастова, С. М. Хомутов, М. В. Донова
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Московской обл., 142290 e-mail.iobastova@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 22.05.2014 г.
При трансформации дегидроэпиандростерона культурой Бр^апа fumoso-rosea ВКМ Б-881 были получены 7а- и 7р-гидроксидегидроэпиандростерон, 3р,7а-дигидрокси-17а-окса-В-гомо-андрост-5-ен-17-он и 3р,7р-дигидрокси-17а-окса-В-гомо-андрост-5-ен-17-он. Выход основного продукта — 3р,7р-дигидрокси-17а-окса-В-гомо-андрост-5-ен-17-она — при нагрузках субстрата 5—20 г/л составил 49.5—72% (мольн.). Формирование лактонов протекало через 7а- и 7р-гидроксипроизводные дегидроэпиандростерона. Структура образуемых продуктов была определена методами масс-спектрометрии, 1Н-ЯМР- и С-ЯМР-спектроскопии. Предложенный микробиологический метод получения стероидных лактонов открывает перспективы для получения новых стероидных соединений.
Ключевые слова: Spicaria, стероиды, дегидроэпиандростерон, 3ß,7a^m^p0KOT-17a-0Kca-D-raM0-андрост-5-ен-17-он, 3ß,7ß-дигидрокси-17а-окса-D-гомо-андрост-5-ен-17-он.
DOI: 10.7868/S0555109915020129
При модификации стероидных структур микроорганизмами особый интерес представляет реакция Байера—Виллигера — введение в кетон кислородного атома между углеродами, один из которых является карбонильным. Реакция этого типа, как правило, осуществляется мицелиальными грибами при деградации стероидной структуры. Она инициируется по кольцу Д и приводит к образованию таких D-гомолактонов, как тестололак-тон. Первые сведения об образовании тестололак-тона из прогестерона микроорганизмами появились в 1953 г. [1, 2]. С тех пор продолжаются интенсивные исследования Байер—Виллигер окисления стероидов микроорганизмами. Способность окислять 3-кетостероиды с образованием 3-оксостероид-D-гомолактонов была обнаружена у мицелиальных грибов различного таксономического положения: Aspergillus [3—5], Penicillium [6—9], Trichoderma [10], Fusarium [11, 12].
Ферменты, осуществляющие реакции введения атома кислорода в структуру кетонов, относятся к, так называемым, Байер—Виллигер монооксигена-зам (БВМО). Несмотря на то, что активность БВМО обнаружена у многих микроорганизмов, к настоящему времени охарактеризовано всего несколько БВМО бактерий и низших эукариот [13, 14].
Субстратами БВМО, как правило, являются 3-оксо-4-ен-стероиды, однако имеются сведения также и об окислении 3(а^)-гидрокси-стерои-
дов с образованием 3(а^)-гидрокси-17а-окса-D-гомолактонов [15, 16]. Образование лактонов из С19- и С21-стероидов с 3ß-гидрокси-5-ен структурой без модификации кольца А было показано для культур Penicillium lilacinum AM 111 [8] и P. camemberti AM 83 [17]. Эти штаммы могли конвертировать прегненолон и 3ß-гидрокси-5-андро-стен-17-он (ДГЭА) до 3ß-гидрокси-17а-окса-D-го-мо-андрост-5-ен-17-она. Начальный этап биоконверсии прегненолона включал деградацию прегнановой боковой цепи с образованием ДГЭА в качестве интермедиата с последующим его окислением до 3ß-гидроксилактона. Следует отметить, что среди продуктов трансформации прегненолона этими штаммами, помимо 3ß-гид-роксипроизводных, были обнаружены соединения с 3-кето-4-ен структурой: прогестерон, андро-стендион и тестололактон. Показана возможность конверсии прегненолона различными путями, как через ДГЭА, так и через прогестерон [8, 17]. Было установлено, что при трансформации ДГЭА штаммом Beauveria bassiana первоначально протекало 11а-гидроксилирование ДГЭА с образованием гидроксипроизводного, которое подвергалось Байер—Виллигер окислению по кольцу Д [18]. Лактонизация кольца Д ДГЭА культурой Aspergillus tamarii KITA сопровождалась 7а-гидроксили-рованием [19].
Наличие функциональной группы при С-11 стероидов способствует их D-лактонизации штаммом A. tamarii KITA (QM 1223), которая не наблюдается при замещениях в других положениях. Например, при наличии кетогруппы в положении С-6 преимущественно происходит восстановление 4,5-двой-ной связи в кольце А [5]. Описано образование ми-целиальными грибами 11а-ОН-тестололактона из 11а-гидроксипрогестерона [5, 6] и Hß-гидрокси-19-нор-тестололактона из 1^-гидрокси-19-нор-те-стостерона [20]. БВМО штамма B. bassiana окисляла только 11а-гидроксилированные C-20 или C-17-кетоны [18].
Стероидные лактоны, являющиеся продуктами реакций Байер—Виллигера, обладают антираковой, антибактериальной и антиандрогенной активностью [21—24]. Исследование биологической активности тестололактона показало, что стероид относится к ингибиторам активности ароматазы человека и потенциально может использоваться для лечения эстроген зависимого рака молочной железы [23]. Помимо этого, ингибиторы ароматазы с лак-тонной структурой используются при изучении роли эстрогенов в возрастных изменениях человека [25, 26].
Важной задачей является разработка новых путей синтеза структурных аналогов тестололактона. Ранее был проведен скрининг мицелиальных грибов, способных конвертировать ДГЭА, в результате которого был обнаружен штамм Spicaria fumoso-rosea ВКМ F-881, эффективно конвертирующий ДГЭА с образованием ряда стероидных продуктов, предположительно, стероидных лактонов [27].
Цель работы — изучение трансформации ДГЭА штаммом S. fUmoso-rosea ВКМ F-881 и оценка эффективности микробиологического получения стероидных лактонов с 3ß,7(а/ß)-диол-5-ен структурой при высоких нагрузках субстрата.
МЕТОДИКА
Материалы. Использовали ДГЭА ("Sigma", США) и 7а-гидроксидегидроэпиандростерон (3ß,7а-дигидрокси-5-андростен-17-он, 7а-ОН-ДГЭА) ("Schering AG," Германия) с чистотой не менее 95%, а также кукурузный ("Sigma-Aldrich", США) и соевый (cultimed) ("Panreac", Испания) экстракты. 7ß-Гидроксидегидроэпиандростерон (3ß,7ß-дигидрокси-5-андростен-17-он, 7Р-ОН-ДГэА) был получен, как описано ранее [27]. Другие материалы и растворители были марок "х. ч." и "ч. д. а." (Россия).
Микроорганизм и его культивирование. Штамм S. fumoso-rosea ВКМ F-881 был получен из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ ИБФМ РАН). Штамм поддерживали на сусло-агаре. Культивирование проводили на качалке (200-220 об./мин) при 29-30°С в колбах Эрлен-
мейера (750 мл) с 50 мл глюкозно-картофельной среды (среда 1), следующего состава (г/л): глюкоза - 20, К2НР04 - 15.2, КН2Р04 -18.1, картофельный экстракт — до 1 л (рН 6.5).
Трансформация ДГЭА, 7а-ОН-ДГЭА, 7Р-ОН-ДГЭА. После 48 ч выращивания 5 мл культуры переносили в 50 мл среды 2 следующего состава (г или мл/л): сахароза — 50, КН2Р04 — 5, MgSO4 — 5, кукурузный экстракт (жидкий) — 20, дистиллированная вода — до 1 л (рН 6.5). Субстрат ДГЭА (2.0 г/л) в виде кристаллического порошка добавляли в среду до стерилизации. Субстраты 7а- и 7Р-ОН-ДГЭА (1.0 г/л) в этаноле вносили одновременно с посевным материалом. Концентрация этанола в среде не превышала 1.0 % (об.). Трансформацию проводили в колбах Эрленмейера (750 мл) на роторной качалке (200—220 об./мин) при 29—30°С.
Культивирование штамма и трансформация ДГЭА при высоких концентрациях (5—20 г/л). Культуру выращивали в течение 48 ч (1-я стадия культивирования) в колбах Эрленмейера (750 мл) на среде 3 (50 мл), следующего состава (г/л): сахароза — 20, соевая мука — 10, соевый пептон — 10, кукурузный экстракт — 5, КН2Р04 — 4, MgSO4 — 1, FeSO4 — 0.01 (рН 6.8—7.0). Полученный посевной материал (5 мл) вносили в колбы Эрленмейера (750 мл) со средой 3 (50 мл) и выращивали 24 ч (2-я стадия культивирования). Посевной материал (5 мл), полученный после второй стадии культивирования, вносили в среду 4 (50 мл, трансформационная среда), следующего состава (г/л): сахароза — 50, соевый пептон — 10, КН2Р04 — 5, MgSO4 — 5 (рН 6.5). После 24 ч инкубирования культуры в среде 4 вносили ДГЭА (5—20 г/л) в растворе диметилформамида (ДМФА) с добавлением твина-80 (0.1%). Концентрация ДМФА в среде составляла 1—3% (об.). Культивирование и трансформацию проводили при 29— 30°С на роторной качалке (200—220 об./мин).
Анализ стероидов. Через каждые 24 ч культивирования из культуральной жидкости отбирали пробы по 1 мл. Стероиды экстрагировали этил-ацетатом (5 мл), при высоких нагрузках субстрата (ДГЭА, 5—20 г/л) — этанолом (4—19 мл).
ТСХ проводили на пластинах "Сорбфил" (УФ 254, Россия) в системах: А — бензол—ацетон (5 : : 3, об./об.); Б — бензол—этилацетат—ацетон (1 : : 1 : 1, об./об./об.) или В — или бензол—ацетон (3 : : 1, об./об.). Визуализацию 3р-гидрокси-5-ен-стероидов осуществляли обработкой пластин 4%-ной фосфорно-молибденовой кислотой в этаноле с последующим нагреванием в течение 3—5 мин при 60—65°С.
Для проведения газожидкостной хроматографии (ГЖХ) стероиды из культуральной жидкости (1 мл) экстрагировали дважды этилацетатом и упаривали досуха при 40°С. Остаток растворяли в 0.4 мл силанизирующей смеси (гексаметилсило-зан—триметилхлорсилан—пиридин, 4 : 1 : 9) и на-
Таблица 1. Хроматографические и масс-спектрометрические характеристики основных продуктов трансформации ДГЭА штаммом Б. fumoso-rosea ВКМ Б-881
Соедине- ТСХ, R f ГЖХ, Главные фрагменты, m/z, (%) Продукты
ние A B C Rt трансформации
ДГЭА (стандарт) 0.90 0.91 0.85 11.62 288[M]+(100), 270[M-H20]+(34), 255[M-H2O-CH3]+(42), 213[M-H2O-C3H5O] +(14), 203[M-C5H90] +(29). -
7а-ОН-ДГЭА (стандарт) 0.42 0.64 0.26 12.17 304[M]+(11), 286[M-H20]+(100), 271[M-H20-CH3]+(10), 253[M-2H2O-CH3]+(6), 243[M-H2O-CH3-CO]+(1), 229[M-H2O-CH3-COCH2]+(3). —
1 0.42 0.64 0.26 12.17 304[M]+(9), 286[M-H20]+(100), 271[M-H20-CH3]+(10), 253[M-2H2O-CH3]+(4), 243[M-H2O-CH3-CO]+(1), 229[M-H2O-CH3-COCH2]+(2). 7а-ОН-ДГЭА
2 0.51 0.75 0.35 12.79 304[M]+(11), 286[M-H20]+(100), 271[M-H2O-CH3]+(11), 253[M-2H2O-CH3]+(4), 243[M-H2O-CH3-CO]+(1), 229[M-H2O-CH3-COCH2]+(2). 7Р-ОН-ДГЭА
3 0.37 0.58 0.22 14.81 320[M]+(6), 302[M-H20]+(100), 287[M-H2O-CH3]+(6), 284[M-2H2O]+(2), 269[M-2H2O-CH3]+(2), 259[M-H2O-CH3-CO] +(1), 245[M-H2O-CH3-COCH2] +(1). 3р,7р-дигид-рокси-17а-ок-са^-гомо-анд-рост-5-ен-17-он
4 0.26 0.44 0.11 14.31 320[M]+(5), 302[M-H20]+(100), 287[M-H2O-CH3]+(7), 284[M-2H2O]+(<1), 269[M-2H2O-
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.