ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 4, с. 421-428
УДК 577.21
ФОРМИРОВАНИЕ КОМПЛЕКСОВ ДНК С АКТИНОМИЦИНАМИ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ И ПЛЕНКАХ
© 2004 г. И. В. Савинцев, Н. Л. Векшин
Институт биофизики клетки РАН, г. Пущино, Московская область, 142290,
e-mail:savintsev@inbi.ras.ru Поступила в редакцию 31.10.2003 г.
Изучен механизм взаимодействия ДНК с актиномицином D (AMD), 7-амино-актиномицином D (7-AAMD), а также этидием бромидом (EtBr) в водных растворах и конденсированном состоянии в пленках на пластинах. Использование методов абсорбционной (в УФ-, ИК- и видимой области) и флуоресцентной спектроскопии (стационарной, поляризационной и фазово-модуляционной) показало, что образование комплекса 7-AAMD с ДНК в растворе не сопровождалось переносом энергии с фотовозбужденных нуклеотидов на фенаксозоновый хромофор антибиотика и встраивание ли-ганда происходило не по типу стэкинга. В пленке комплекса ДНК-7-AAMD, моделирующей натив-ное состояние в клетке, наблюдалась высокая эффективность переноса энергии, что свидетельствовало об интеркаляции актиномицина в ДНК по стэкинговому типу. В больших концентрациях 7-AAMD в пленке индуцировал денатурацию ДНК, нарушая двуспиральную структуру. В комплексе с AMD молекула ДНК сохранялась в нативной В-форме как в пленках, так и в растворе.
Антибиотики актиномицинового ряда в течение нескольких десятилетий используются в медицинской практике для лечения инфекционных и онкологических заболеваний [1, 2]. Действие актиномицинов основано на их способности формировать комплекс с молекулой ДНК, стерически ингибировать РНК-полимеразную реакцию, подавлять биосинтез белка, рост клеток и тканей [3]. Поиск более эффективного для медицинского использования препарата (с меньшим токсическим действием, повышенной проницаемости) привел к созданию большого количества производных. В настоящее время актиномицины и их производные широко используются также в научно-исследовательской работе. Установлено, что актиноми-цин является пролонгатором жизненного цикла животных [4]. Возможность использования актиномицина как в научно-исследовательской работе, так и в медицине осложняется недостаточным пониманием его действия на клетку, отсутствием единого представления о механизме формирования комплексов с ДНК. Остаются не изученными особенности взаимодействия с нуклеопротеидны-ми структурами, клеточными органеллами; не разработаны способы направленной доставки актиномицина и уменьшения его побочного токсического действия на организм.
Молекула актиномицина Б, типичного представителя этой группы антибиотиков, состоит из пептидолактонной группы и плоского феноксазо-нового хромофора и поэтому способна образовывать с молекулой ДНК различного рода связи [5, 6]. В литературе обсуждается способность актиномицина интеркалировать в ДНК по типу стэкинга, т.е.
путем встраивания феноксазонового хромофора между азотистыми основаниями параллельно их плоскостям [7, 8]. Такая интеркаляционная модель основана, в первую очередь, на данных, полученных при изучении кристаллов и высококонцентрированных растворов комплексов.
При изучении структуры и свойств комплексов биологически активных веществ с ДНК традиционно используются прямые структурные методы, например рентгено-структурный анализ, позволяющий получить информацию о стерических характеристиках комплексов, идентифицировать группы атомов и типы взаимодействий, участвующие в их формировании, определить способы межмолекулярных взаимодействий. Объектом непосредственного применения таких методов в большинстве случаев являются кристаллы или высококонцентрированные растворы. Такой методический подход является моделированием взаимодействий биологически активных веществ с клеточной ДНК, конденсированной в нуклеопротеидные или нуклео-липидные комплексы. Полученные структурные данные экстраполировались на понимание этих взаимодействий в растворе со "свободной" ДНК. Однако важно знать, в какой степени структура и свойства комплексов в твердом, конденсированном состоянии соответствуют механизмам ком-плексообразования при низких концентрациях в растворе; насколько различаются взаимодействия с конденсированной ядерной ДНК и ДНК, свободной от комплексов.
В работе предлагается сравнительно-аналитический метод спектроскопического исследования
комплексообразования ДНК с биологически активными веществами в растворе при физиологических концентрациях и в конденсированном состоянии в пленках как модели взаимодействия ак-тиномицинов с ДНК в различном состоянии в клетке. Полученные данные могут быть в дальнейшем использованы для направленного синтеза молекулярных аналогов актиномицина, оптимизации их медицинского использования в зависимости от состояния ДНК (конденсированное или свободное от комплексов), стадии клеточного цикла, уровня митотической активности ткани, стадии роста опухоли.
Цель работы - исследование различий комплексообразования актиномицинов с растворенной двуспиральной и конденстрованной ДНК в клетке путем моделирования этих состояний ДНК в растворе и в пленке.
МЕТОДИКА
Использовали актиномицин D ("Reanal", Венгрия), 7-амино-актиномицин D ("Fluka", Чехия), химически чистый этидий бромид (Россия), а также ДНК тимуса теленка, выделенную из животной железистой ткани, наиболее подверженной опухолевым процессам, ("Serva", Германия) с молекулярной массой 104 кДа.
В основе предлагаемой методики лежит сравнение оптических и спектральных свойств раствора и пленки одного и того же объекта. Для этого необходимо, чтобы при спектроскопических измерениях пучок света спектрального прибора проходил через часть образца (пленки и раствора), содержащую одинаковое количество вещества. Для этого при изготовлении пленки на кварцевую (флюоритовую) подложку наносили раствор с таким же количеством вещества, которое содержится в сравниваемом растворе. Площадь поверхности пленки должна быть равна площади стороны объема кюветы, занимаемого раствором, и быть максимально однородной по толщине. При измерении спектров поглощения пленки в канале сравнения спектрофотометра должна находится чистая кварцевая (флюоритовая) подложка, а при измерении спектров растворов кювета с буфером. Только при выполнении этих условий возможно применение закона Ламберта-Бэра для сравнения спектральных свойств пленки и раствора [9, 10]:
D = £n/s, (1)
где D - оптическая плотность образца, £ - коэффициент экстинкции хромофора, n - число хромофорных молекул в освещаемом объеме, 5 - освещаемая площадь.
Значения n и 5 для пленки и раствора были одинаковы, изменение оптической плотности в данных экспериментах может быть только след-
ствием изменения коэффициента экстинкции. Закон здесь приведен в такой форме для наглядной демонстрации возможности его применения в данном методическом подходе. Традиционная форма записи Закона D = eCl, где C - молярная концентрация, l - длина оптического пути.
При этом в растворе ДНК концентрация 7-AAMD или EtBr была 2 мкМ, а соотношение молярных концентраций этих красителей и нуклео-тидов равно 1 : 6, концентрация ДНК в пересчете на нуклеотиды 12 мкМ.
Использовали микрокюветы с длиной оптического пути 4 мм. Объем раствора 200 мкл. Раствор в кювете занимал площадь стороны 50 мм2 (4 х 12.5 мм). При изготовлении пленки в этом случае нужно на ограниченную площадь подложки (4 х 12.5 мм) нанести этот же раствор или раствор меньшего объема, но с таким же количеством вещества. Раствор меньшего объема предпочтительнее, т.к. это дает возможность одноразового нанесения всего объема, что ведет к большей однородности пленки по толщине. Пленки самопроизвольно высыхали в течение 1 сут при комнатной температуре и влажности на строго горизонтальной поверхности. При определении концентраций актиномицинов использовали значения коэффициентов экстинкции, приведенные в [11].
Флуоресценцию 7-AAMD регистрировали в дипазоне от 580 до 700 нм (возбуждение - 530 нм), этидия бромида - в диапазоне от 570 до 670 нм (возбуждение - 500 нм) на флуориметре "Perkin-Elmer MPF-44B" (США) со щелями монохромато-ров 12 нм на возбуждении и 10 нм на испускании при регистрации спектров эмиссии и наоборот -при регистрации спектров возбуждения. Спектры возбуждения детектировали при 650 нм для 7-AAMD и при 610 нм для этидия бромида.
Растворы исследуемых образцов объемом 200 мкл помещали в кварцевые 4 мм микрокюветы; при этом площадь эффективного сечения образца, составляла 50 мм2. При смешивании 7-AAMD или этидия бромида с ДНК в первые 1-2 мин наблюдались изменения интенсивности флуоресценции, поэтому перед началом всех флу-ориметрических измерений смеси выдерживали несколько минут. Параметры флуоресценции не зависели от очередности добавления компонентов. Спектры флуоресценции пленок снимались при ориентации около 45° к падающему свету. При этом пластинка с пленкой фиксировалась в держателе так, чтобы отраженный возбуждающий свет уходил в сторону, противоположную светосбору флуоресценции. Время жизни флуоресценции определяли фазовым методом [12] на фазово-мо-дуляционном спектрофлуориметре "SLM-4800" (США) при частоте модуляции 30 МГц и щелях монохроматора возбуждения ~1 нм и монохрома-
тора излучения 16 нм. УФ-спектры поглощения регистрировали на спектрометре "Брекогё М-40".
Количество молекул (Ы), донирующих возбуждение на одну молекулу акцептора, и эффективность переноса энергии (0 определяли по формулам [13, 14].
N = (2)
й = ^М/^М. (3)
Здесь Еш - интенсивность сенсибилизированной флуоресценции акцептора, возбуждаемого в донорной полосе поглощения, Еа - интенсивность флуоресценции акцептора, возбуждаемого в его собственной полосе, £а - коэффициент экстинк-ции акцептора, гл - коэффициент экстинкции донора, [а] - концентрация акцептора, [Щ] - концентрация донора.
Пленки для ИК-спектроскопического анализа готовили на флюоритовых пластинках. Для этого растворы комплексов в дистиллированной воде с концентрацией ДНК 1-2 мг/мл наносили на флю-оритовые пластинки, которые затем высушивали в эксикаторе над Р205. Денатурированную ДНК получали путем прогрева на кипящей водяной бане в течение 30 мин с последующим быстрым охла
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.