ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 3, с. 355-365
УДК 581.1
ФОРМИРОВАНИЕ ПИГМЕНТНОГО АППАРАТА В ЭТИОЛИРОВАННЫХ ЛИСТЬЯХ ЯЧМЕНЯ ПОД ВЛИЯНИЕМ
ЛЕВУЛИНОВОЙ КИСЛОТЫ
© 2004 г. Г. Е. Савченко, Е. А. Ключарева, Л. М. Абрамчик
Институт фотобиологии Национальной академии наук Белоруссии, Минск Поступила в редакцию 20.08.2003 г.
Изучали влияние левулиновой кислоты (ЛК) на синтез пигментов и мембранную систему этиопла-стов в этиолированных листьях ячменя (Hordeum vulgare L.). Выращивание на растворе ЛК в течение 6 сут (через сутки после замачивания семян) приводило к задержке роста листа, более чем двукратному снижению содержания каротиноидов и протохлорофиллида (Пд) в ткани листа и ингиби-рованию образования длинноволновой формы Пдб55, зависящему от концентрации ЛК. В этиопластах, выделенных из проростков, содержащих в результате действия ЛК (50 мкМ) преимущественно коротковолновую форму Пд с максимумом флуоресценции в области 632 нм (-196°С), присутствовала фракция мембран, идентичная по положению в градиенте плотности сахарозы про-ламеллярным телам (ПЛТ) контрольного варианта. Содержание Пд и каротиноидов в этой фракции в расчете на белок было соответственно в 2.46 и 1.3 раза ниже, чем в контроле, а относительное количество Пд-оксидоредуктазы (ПОР) практически не изменилось. Таким образом, ингибирова-ние синтеза Пд не повлияло на транспорт ПОР из цитоплазмы в мембраны этиопластов. В мембранах ПЛТ не удалось обнаружить переноса энергии с молекул липофильного флуоресцентного зонда пирена (возбуждение при 337, 278 и 296 нм) на Пд, но в условиях дефицита пигментов в них возрастала эффективность образования эксимерной формы пирена за счет переноса энергии с триптофа-нилов белка (возбуждение при 278 и 296 нм), свидетельствующая об изменении белок-липидных взаимодействий. Полученные результаты позволили заключить, что коротковолновая форма Пд632, накапливающаяся в этиопластах при ингибировании синтеза тетрапирролов, не является свободным пигментом.
Hordeum vulgare - левулиновая кислота - этиопласты - проламеллярные тела - протохлорофил-лид и его формы - протохлорофиллидоксидоредуктаза - каротиноиды - флуоресценция - пирен -дифенилгексатриен
Левулиновая кислота (ЛК) подавляет хлоро-филлообразование путем действия на дегидрата-зу 5-аминолевулиновой кислоты (АЛК) [1]. В результате синтез тетрапирролов прерывается на стадии образования порфобиллиногена и накапливается АЛК. ЛК используют для остановки светоиндуцированного хлоропластного развития, которое может быть обратимым при отмывке кислоты без токсических эффектов [2, 3]. С помощью ЛК можно существенно снизить накопление протохлорофилловых пигментов - конечных продуктов темнового синтеза хлорофилла в по-
Сокращения: АЛК - 5-аминолевулиновая кислота, ЛК - левулиновая кислота, Пд - протохлорофиллид, ПЛТ - проламеллярные тела, ПТ - протилакоиды, ПОР - протохлоро-филлидоксидоредуктаза, БРИ - дифенилгексатриен, г5 -стационарная анизотропия.
Адрес для корреспонденции: Савченко Галина Евсеевна. 220072 Беларусь, Минск, Академическая ул., 27. Институт фотобиологии НАНБ. Электронная почта: ipb@biobel.bas-net.by
крытосеменных растениях. При этом открываются возможности для изучения ряда регулятор-ных проблем биогенеза пигментного аппарата растений: координации синтеза протохлорофиллида (Пд) и фермента, осуществляющего его восстановление, - Пд-оксидоредуктазы (ПОР) [4], механизмов сборки внутриэтиопластных мембран, а также роли протохлорофилловых пигментов и ПОР в их структуре. Исследование этих вопросов было основной целью нашей работы.
Обычно дефицит пигментов создают путем инкубации листьев на растворе ЛК в течение нескольких часов или суток [3]. В наших экспериментах проростки формировались на растворе ЛК с момента прорастания семян. При этом особый интерес представляли исследования количественных аспектов ингибирования синтеза пигментов, тесно связанные с проблемой общего пластидогенеза и биогенеза системы внутренних мембран этиопластов в условиях подавления синтеза тетрапирролов.
355
3*
Таблица 1. Изменение морфологии проростков ячменя при выращивании на растворе ЛК (20 мМ) с 3- до 7-дневного возраста
Вариант n Длина листа, мм Длина колеоптиля, мм Лист/колеоитиль, %
Контроль 48 92.38 ± 1.89* 75.63 ± 1.42 122
ЛК 46 71.13 ± 2.29* 73.8 ± 1.25 96
* Различия в длине листа между контрольным и опытным вариантами достоверны при уровне значимости <0.001.
Известно, что зрелые этиопласты содержат полукристаллические проламеллярные тела (ПЛТ), в которых сосредоточена основная масса ПОР и Пд, и плоские протилакоиды (ПТ), различающиеся содержанием пигментов и белковым составом [5]. В рамках настоящей работы было важно выяснить, как будет формироваться мембранная система этиопластов при постоянном дефиците тет-рапирролов и изменится ли в ней характер белок-липидных взаимодействий. С этой целью исследовали флуоресцентные параметры липофильного зонда пирена [6], встроенного в мембраны, выделенные из этиопластов с нормальным или модифицированным с помощью Лк содержанием пигментов. Для оценки изменений микровязкости липидного слоя внутриэтиопластных мембран использовали другой флуоресцентный зонд - дифе-нилгексатриен (DPH) [7].
В результате проведенных исследований обнаружено ингибирующее влияние ЛК не только на синтез тетрапирролов, но и каротиноидов как в целом проростке, так и в системе внутриэтиопластных мембран. При формировании последней отсутствовала положительная корреляция между содержанием синтезирующегося в этиопласте Пд и поступающей в пластиду ПОР, количество которой не подвергалось воздействию со стороны ЛК. При дефиците тетрапирролов Пд накапливался в мембранах этиопластов преимущественно в неактивной, но связанной с белком форме (Пд632).
МЕТОДИКА
В работе использовали этиолированные проростки ячменя (Hordeum vulgare L., сорт Березин-ский). В экспериментах, требующих большого количества материала, растения выращивали на вате, смоченной водопроводной водой, при 23-26°С в больших эмалированных сосудах. При этом в опытном варианте семена сначала замачивали в водопроводной воде в течение суток, а затем продолжали выращивать на растворе ЛК (10, 20 либо 50 мМ). Закисленную в результате действия ЛК среду нейтрализовали с помощью насыщенного раствора карбоната калия до рН 6. В специальных опытах для контроля параметров роста проростки выращивали в течение 3 сут в рулонах фильтровальной бумаги, погруженных в сосуд с дистиллированной водой. За это время за-
ключенный в колеоитиль лист выходил из зерновки на 1 см. Затем растения оиытного варианта иереносили на раствор ЛК (20 мМ) и иродолжали выращивать еще в течение 4 сут (морфометриче-ские данные этого эксиеримента ириведены в табл. 1).
Этиопласты и внутрипластидные мембраны. Гомогенат растительных тканей в Tes-Hepes-бу-фере c сахарозой сначала очищали от ядер и круиных клеточных фрагментов центрифугированием ири 400 g, а затем из суиернатанта выделяли фракцию этиоиластов центрифугированием ири 1500 g. После иромывки, иереосаждения (2500 g) и осмотического шока этиоиластов внут-рииластидные мембраны осаждали ири 9000 g. ПЛТ отделяли от иластидной оболочки и ПТ дифференциальным центрифугированием в градиенте илотности сахарозы [8], но без добавления НАДФ ■ Н на заключительных стадиях выделения.
Анализ пигментов. Пигменты экстрагировали из ироростков в смеси ацетона с 0.1 М NH4OH (9 : 1, ио объему). Для оценки содержания иротохлоро-филловых иигментов и каротиноидов во фракциях мембран этиоиластов квоты мембран оиытного и контрольного вариантов, выравненные ио содержанию белка, иереводили в ацетон (конечная концентрация иоследнего - 80%). Количество Пд и каротиноидов в ацетоновых экстрактах тканей листа или мембран этиоиластов оиределяли сиектрофотометрически ио [9, 10].
Низкотемпературные спектры флуоресценции. Состояние иротохлорофилловых молекул в нативных листьях оценивали ио сиектрам флуоресценции листьев в жидком азоте, регистрируемым на установке, собранной в Лаборатории биофизики и биохимии фотосинтетического аииара-та Института фотобиологии НАНБ [11].
Определение содержания ПОР. В работе ис-иользовали одну из модификаций неирямого, твердофазного иммуноферментного метода (ELISA) [12]. В качестве иервичных антител ирименяли антитела иротив ПОР из этиоиластов ишеницы, вторичными являлись конъюгированные с ие-роксидазой антикроличьи антитела ("Sigma", США). Субстратом иероксидазы служил орто-фенилендиамин. Мерой относительного содержа-
Длина волны, нм
Рис. 1. Изменение соотношения форм протохлорофилловых пигментов в листьях ячменя, выращенных на растворе ЛК разной концентрации. 1 - H2O, 2 - 10 мМ ЛК, 3 - 20 мМ ЛК, 4 - 50 мМ ЛК. Приведены низкотемпературные (-196°С) спектры флуоресценции верхней трети листа. Возбуждение при 440 нм.
ния ПОР служил угол наклона линейного участка кривых титрования антител антигеном [13].
Определение содержания белка. Количественное содержание белка в ткани листа и в мембранах этиопластов определяли по модифицированному методу Lowry [14].
Флуоресцентные зонды. В работе использовали пирен и дифенилгексатриен (DPH) (оба - фирмы "Serva", Германия). Зонды встраивали в исследуемые мембранные фракции при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Для работы использовали маточный раствор пирена (6 мМ в этаноле), который разбавляли Tes-Hepes-буфе-ром (рН 7.2) в соотношении 1 : 100, встряхивали и вносили в суспензию нативных мембран (0.1 мл/мг белка), ресуспендированных тем же буфером, в количестве, необходимом для достижения соответствующей конечной концентрации зонда (от 1 до 6 мкМ) [15]. Спектрофлуориметрический анализ обычно проводили спустя 10-15 мин после
Рис. 2. Относительное содержание ПОР в ПЛТ, выделенных из этиолированных растений контрольного варианта (1) и проростков, выращенных на 50 мМ растворе ЛК (2).
Данные иммуноферментного анализа. На оси ординат - оптическая плотность орто-фенилендиамина -субстрата пероксидазы, конъюгированной с антикроличьими антителами, отражающая присутствие в анализируемом материале антигена, связавшегося с антителами против ПОР.
введени
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.