БИОЛОГИЯМОРЯ, 2015, том 41, № 1, с. 46-54
УДК 591.1.05+592/595+574.2 СРАВНИТЕЛЬНАЯБИОХИМИЯ
ФОСФАТАЗЫ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ И ИГЛОКОЖИХ ЯПОНСКОГО И ОХОТСКОГО МОРЕЙ1
© 2015 г. А. В. Сейткалиева, Н. И. Мензорова, В. А. Рассказов
Тихоокеанский институт биоорганической химии -им. Г.Б. Елякоеа (.ТИБОХ)ДВО РАН, Владивосток 690022
e-mail: sasha0788@inbox.ru
Статья принята к печати 18.09.2014 г.
В качестве потенциальных источников фосфатаз исследованы 35 видов дальневосточных морских беспозвоночных. Определена активность кислых (КФ) и щелочных (ЩФ) фосфатаз в гонадах и пищеварительной системе у семи видов моллюсков и 28 видов иглокожих. У разных групп морских беспозвоночных выявлена значительная вариабельность активности ферментов. Показано, что в органах изученных животных активность КФ была выше, чем ЩФ. Впервые предпринят поиск цистеиновых солеустойчивых ЩФ у морских беспозвоночных. ЩФ, сохраняющие активность в морской воде, обнаружены в гонадах и пищеварительной системе морских ежей, а также в пищеварительной системе морской звезды Henricia sp. Цистеиновые ЩФ выявлены в гонадах четырех видов морских ежей и морской звезды Ceramaster patagonicus. Среди изученных иглокожих цистеиновые солеустойчи-вые ЩФ обнаружены только в зрелых яйцеклетках и гонадах морских ежей, что, вероятно, связано с особенностями процесса оогенеза у этих животных.
Ключевые слова: кислые и щелочные фосфатазы, иглокожие, моллюски, яйцеклетки и гонады морского ежа, солеустойчивость.
Phosphatases of echinoderms and bivalve mollusks of the Japan and Okhotsk seas. A.V. Seitkalieva, N.I. Menzorova, V.A. Rasskazov (G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far East Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690022)
For the first time, 35 species ofthe Far Eastern marine invertebrates have been studied as potential sources ofphos-phatases. The enzymatic activity of acid (ACP) and alkaline (ALP) phosphatases in the gonads and digestive organs has been investigated in seven species of mollusks and 28 species of echinoderms. Significant variability of the enzymatic activity has been revealed within different groups ofthe organisms studied. It was shown that the activity of ACPs in the bodies of all the studied animals was higher than that of ALPs. For the first time, an attempt was made to search for the cys-teine-containing and salt resistant ALPs in marine invertebrates. The ALPs retaining their activity in seawater were found in the gonads and digestive organs of sea urchins, as well as in the digestive organs of the starfish Henricia sp. The presence of cysteine ALPs has been detected in the gonads of four sea urchin species and the starfish Ceramaster patagonicus. Among the studied echinoderms, the cysteine-containing and salt resistant ALPs have been found only in mature oocytes and gonads of sea urchins; this is probably related to the peculiarities ofthe oogenesis process in sea urchins. (Biologiya Morya, 2015, vol. 41, no. 1, pp. 46-54).
Keywords: acid and alkaline phosphatases, echinoderms, mollusks, eggs and gonads of sea urchins, salt resistant.
Экстремальные условия обитания морских организмов являются причиной некоторых изменений в структуре и, как следствие, в свойствах белков. Среди необычных свойств ферментов морских животных можно отметить относительно высокую удельную активность, а также устойчивость к денатурации под воздействием высоких температур и концентраций солей. Как правило, объектами изучения служат фосфатазы представителей наземной фауны и флоры, ферментам морских организмов посвящено гораздо меньшее количество работ.
Фосфатазы - ферменты, широко распространенные среди самых разных биологических объектов (от архебактерий до млекопитающих), что подтверждает их фундаментальную роль в биохимических процессах. Неспецифические фосфатазы (фосфомоноэстеразы) относятся к классу гидролаз, катализируют гидролиз эфирных связей с образованием неорганического фос-
фата и классифицируются согласно их оптимуму рН как щелочные фосфатазы (КФ 3.1.3.1, оптимум рН > 8.0) и кислые фосфатазы (КФ 3.1.3.2, оптимум рН < 6.0). Литературных данных об активности и свойствах фосфатаз морских беспозвоночных мало, порой они противоречивы, так как в экспериментах часто используются разные субстраты и методы определения активности ферментов.
Кислые фосфатазы (КФ) - одни из самых распространенных ферментов метаболизма, обладающие видо-и тканеспецифичностью, поэтому их каталитическая активность существенно зависит от источника фермента. Кислые фосфатазы, ранее обнаруженные в гонадах и печени трех видов тихоокеанских кальмаров и двух видов крабов (Розенгарт и др., 1993; Розенгарт, Басова, 2009), а также в печени креветки (Чен и др., 2000) и двух видов двустворчатых моллюсков (Лп§ й а!., 2006; Магогга й
1 Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 14-04-10092).
al., 2002), были частично охарактеризованы. Показано присутствие КФ в яйцеклетках двух видов морских ежей из Средиземного моря (Yokota, 1986), в яйцеклетках и эмбрионах трех видов морских ежей из Японского моря (Yokota, Nakano, 1984); на гомогенатах изучены их некоторые свойства. Наиболее высокая активность КФ обнаружена в пищеварительной системе, что указывает на важную роль этого лизосомального фермента в процессах пищеварения морских беспозвоночных.
К настоящему времени накоплено значительное количество экспериментальных данных, позволяющих описать свойства, первичную структуру и конформацию щелочных фосфатаз (ЩФ) наземного происхождения. Так же подробно изучены свойства ЩФ у сравнительно небольшого числа морских беспозвоночных. Высокая фосфатазная активность отмечена в гепатопанкреасе ракообразных: различных видов крабов (Zhang et al., 2001; Pinoni, Lopez Mananes, 2004; Мензорова и др., 2008), креветок (Chuang, 1990; Lee, Chuang, 1991; Nilsen et al., 2001) и ветвистоусых раков (Zhao et al., 2006). Обнаружены ЩФ в печени и почках двух видов головоногих моллюсков (Розенгарт и др., 2009), во внутренних органах двустворчатых моллюсков (Xiao et al., 2002; Кси и др., 2008) и в тканях морской звезды (Aisa et al., 1982). Опубликованы сведения о присутствии ЩФ в сперми-ях (Anderson, 1968), яйцеклетках и эмбрионах морских ежей, обитающих в Средиземном море (Pfohl, 1975), и в яйцеклетках морских ежей из Японского моря (Ващенко и др., 1990; Durkina, Evtushenko, 1991; Menzorova et al., 2014). Однако мы не нашли информации, посвященной сравнительному исследованию ЩФ в тканях морских беспозвоночных.
Щелочные фосфатазы, выделенные из клеток микроорганизмов и тканей различных органов позвоночных, как правило, связаны с клеточными мембранами, максимальная активность этих ферментов наблюдается в диапазоне pH от 9.0 до 10.5 (Зуева и др., 1993). В морских макро- и микроорганизмах ЩФ могут существовать одновременно в двух формах - мембраносвязанной и растворимой, с оптимум pH также выше 9.0 (Мугинова и др., 2005). На данный момент pH-оптимум ниже 9.0 определен для растворимых форм всего нескольких ЩФ. Это внеклеточные ферменты некоторых микроорганизмов, расщепляющие субстрат в морской воде (Rina et al., 2000; Wojciechowski et al., 2002), и внутриклеточные ферменты, выделенные из гепатопанкреаса разных видов креветок (pH 8.5-9.0), некоторых видов крабов (pH 7.5-8.0), и из яйцеклеток морских ежей (pH 7.8-8.3) (Chuang, 1990; Lee, Chuang, 1991; Pinoni, Lopez Mananes, 2004; Мензорова и др., 2008; Menzorova et al., 2014).
Щелочные фосфатазы - это металлоферменты, содержащие в активном центре ионы цинка, необходимые для проявления каталитической активности. Многие ЩФ одновременно являются металлозависимыми ферментами, т.е. ионы Ме2+ не только стабилизируют структуру, но и играют важную роль в катализе, зна-
чительно повышая активность ферментов (Зуева и др., 1993). Влияние ионов одновалентных металлов (К+, Na+) изучено в меньшей степени, считается, что концентрации 5-50 мМ оказывают на активность некоторых ЩФ слабое активирующее действие, а концентрации выше 100 мМ - ингибирующее. В то же время известно, что умеренно галофильные бактерии могут жить и размножаться в среде с концентрацией NaCl от 0.5 до 2.5 М, а экстремально галофильные организмы (археи) - в насыщенном солевом растворе (6 М NaCl). Однако, если ЩФ из Halobacterium salinarum (археи) сохраняет ферментативную активность при концентрации NaCl 4 М (Wende et al., 2010), то ЩФ из умеренно галофильной бактерии Halomonas sp. 593 обладает максимальной активностью в отсутствии NaCl (Ishibashi et al., 2011).
Ранее нами показано, что ЩФ, выделенная из яйцеклеток морского ежа Strongylocentrotus intermedius (Stffl,®), обладает необычными для неспецифических фосфатаз свойствами (Menzorova et al., 2014). Во-первых, это солеустойчивый фермент, гидролизующий субстрат без потери активности в природной морской воде (33%о, рН 7.8-8.2) или в стандартном буфере в присутствии 2.5 М NaCl. Во-вторых, при добавлении дитио-треитола (ДГТ) активность Stffl,® увеличивается в несколько раз. Данный реагент восстанавливает S-S связи в белках до SH-групп и увеличивает активность цистеи-новых ферментов, которым эти группы необходимы для ферментативного катализа. По литературным данным, неспецифические ЩФ из разных источников отличаются количеством S-S связей, участвующих в образовании димера, поэтому в присутствии ДГТ их ферментативная активность либо сохраняется, либо понижается (Зуева и др., 1993; Мугинова и др., 2005). Свойство Stffl,® сохранять активность в природной морской воде было использовано в ферментативной тест-системе для оценки качества морских и минерализованных пресных вод (Menzorova et al., 2014).
Несмотря на интенсивное изучение фосфатаз, их физиологическая роль исследована недостаточно. Кислые фосфатазы принимают участие во многих лити-ческих процессах, связанных с работой лизосом и лежащих в основе анаболизма, таким образом они оказываются вовлеченными в узловые биохимические процессы (Диксон, Уэбб, 1982). В морских организмах ЩФ играют важную роль в клеточном метаболизме фосфатов, один из этапов которого связан с абсорбцие
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.