МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 1, с. 28-32
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.222+579.262
ФОСФАТСОЛЮБИЛИЗИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ АЭРОБНЫХ МЕТИЛОБАКТЕРИЙ
© 2014 г. Н. В. Агафонова, Е. Н. Капаруллина, Н. В. Доронина, Ю. А. Троценко1
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Пущинский государственный естественно-научный институт Поступила в редакцию 10.06.2013 г.
Обнаружена фосфатсолюбилизирующая активность у 14 штаммов аэробных метилобактерий, ассоциированных с растениями и принадлежащих к родам МвШуЬркПт, МеШуЬЬаеШт, Ме^уЬуогыз, Ме-ШуЬрИа, Ме^уЬЬааепыт, Бе1/Иа и ЛпеуЬЬааег. Рост метилобактерий на среде с метанолом — источником углерода и энергии, и нерастворимым трикальцийфосфатом в качестве источника фосфора сопровождался снижением рН вследствие накопления интермедиата окисления метанола — муравьиной кислоты (до 7 мМ) и высвобождением от 120 до 280 мкМ ионов фосфора, который может использоваться как бактериями, так и растениями. Фосфатсолюбилизирующая активность — новая выявленная роль метилобактерий как фитосимбионтов.
Ключевые слова: аэробные метилобактерии, фитосимбиоз, фосфор, солюбилизация.
DOI: 10.7868/S0026365614010029
Фосфор — второй после азота элемент минерального питания, дефицит которого ограничивает рост и развитие как микроорганизмов, так и растений, которые способны поглощать фосфаты, главным образом, в виде ионов — H2PO4 и
HPO4 , в зависимости от рН почвы [1]. Но в окружающей среде минеральный фосфор представлен, в основном, в виде нерастворимых фосфатов (трикальцийфосфата, апатитов, оксиапатитов, гидроксиапатитов, фосфорсодержащих горных пород), практически недоступных для растений [2]. Известно, что фосфорное питание растений может быть улучшено при инокуляции их микроорганизмами, способными растворять минеральные фосфаты почвы [3—6]. Описаны фосфатсолю-билизирующие микроорганизмы, выделяющие органические кислоты: лимонную, масляную, молочную, янтарную, яблочную, глюконовую, уксусную, гликолевую, фумаровую и а-кетоглутаровую, которые растворяют минеральные фосфаты за счет снижения рН [3, 7—10].
Аэробные метилотрофные бактерии — мети-лобактерии, использующие метанол или другие С1-соединения, но не метан, в качестве источника углерода и энергии, находятся в тесной взаимосвязи с растениями, успешно колонизуют мхи, печеночники, лишайники, голо- и покрытосе-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: trotsenko@ibpm.push-chino.ru).
менные растения, в том числе реализующие различные типы фотосинтеза [11—16]. Растения являются глобальным источником атмосферного метанола, который образуется при деметилирова-нии пектина клеточных стенок при росте клеток растений [17—18]. Аэробные метилобактерии являются фитосимбионтами, поскольку используют естественные продукты метаболизма растений в качестве источников углерода и энергии, и прямо (синтез фитогормонов, витаминов, редукция выделения этилена) или косвенно (синтез сиде-рофоров, противогрибковых веществ) действуют на растение [19]. Однако способность аэробных метилобактерий к солюбилизации нерастворимых фосфатов до настоящего времени не определяли.
Цель данной работы — исследовать способности представителей разных таксонов аэробных метилобактерий, ассоциированных с различными растениями, к растворению минеральных фосфатов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования. 14 штаммов метилобактерий, выделенных ранее из филлосферы и ризосферы различных растений: Methylophilus fla-vus Ship VKM B-2547 изолят из филлосферы шиповника (Rosa cinnamomea L.), Methylobacterium extorquens штаммы G10 и Ps2 — из ризосферы свеклы (Beta vulgaris L.), Methylobacillus arboreus
ФОСФАТСОЛЮБИЛИЗИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ АЭРОБНЫХ МЕТИЛОБАКТЕРИЙ
29
Iva VKM B-2590 — из почек ивы (Salix fragilis L.), Methylovorus menthalis MM VKM B-2663 — из корневища мяты (Mentha arvensis L.), Methylopila musalis MUSA VKM B-2646 - из плода банана (Musa paradisiaca var. sapientum), Methylovorus mays C VKM B-2221 — из ризосферы и филлосферы кукурузы (Zea mays L.), Methylobacterium nodulans ORS2060 — из клубеньков бобового растения Crotalaria podocarpa, Delftia sp. Lp-1 DSM 24446 — из клубеньков люпина (Lupinus polypholium L.), Ancylobactersp. Osot — из корней осота (Sonchus arvensis L.), Methylopila capsulata штаммы Minsk — из корней осоки (Carex sp. L.) и Sb — из филлосферы рябины (Sorbus sp. L), Methylopila turkiensis Sidel VKM B-2748 — из филлосферы бугенвиллеи (Bougainvillea sp. L.), Methylovorus fructoseoxidans 34 VKM B-1609 — из ризосферы риса (Oryza sativa L.).
Условия культивирования. Культуры выращивали на агаризованной минеральной среде "К", как описано ранее [20]. Способность к растворению фосфатов анализировали двумя способами: 1 — на агаризованной и 2 — жидкой среде "К" с метанолом (0.5% об/об) (добавляли на 3, 6 сутки культивирования) и Ca3(PO4)2 в концентрации 5 г/л в качестве единственного источника фосфора. Высев в жидкую среду осуществляли смывом клеток с ага-ризованной среды для предотвращения внесения растворимых форм фосфора. Концентрацию ко-лониеобразующих единиц (КОЕ/мл) в жидкой среде определяли высевом разведенных бактериальных суспензий (10N раз) на чашки с минеральной агаризованной средой с метанолом. Концентрацию растворимых форм фосфора определяли в культуральной жидкости с помощью реактива "Р", содержащего растворы 1 и 2. Раствор 1: (NH4)6Mo7O24 • 4H2O — 3%-ный раствор в 2%-м растворе Тритона Х-100 (4 мл Тритона Х-100, 196 мл деионизованной воды, 6 г (NH4)6Mo7O24 • • 4H2O). Раствор 2: малахитовый зеленый — 0.06% раствор в 6 н HCl (100 мл 6 н HCl, 0.06 г малахитового зеленого). Растворы 1 и 2 смешивали (1 : 1) и через сутки отфильтровывали. Для определения фосфатов к 2 мл культуральной жидкости добавляли 1 мл реактива "Р", выдерживали 15 мин при комнатной температуре. Калибровочную кривую строили со стандартными растворами KH2PO4. Измерения проводили на спектрофотометре Shi-madzu — UV1700 (Япония) при 614 нм.
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Идентификацию муравьиной кислоты в культуральной жидкости штаммов осуществляли с помощью жидкостного хроматографа LC-20AD ("Shimadzu", Япония), оснащенного дегазатором Shimadzu DGU-20A3 (Япония). Детекцию муравьиной кислоты проводили с помощью УФ-детектора Shimadzu SPD-20A (Япония) при 210 нм. Аликвоту образца объемом 9 мкл наносили на колонку Repro Gel (250 х 8 мм;
5 мкм). Элюцию осуществляли со скоростью 1 мл/мин мобильной фазой, содержащей 9 мМ серную кислоту, при длине волны 210 нм. В качестве стандарта использовали 85% НСООН.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На агаризованной минеральной среде "К" с нерастворимым Са3(РО4)2 в качестве единственного источника фосфора через 10 сут культивирования появились зоны просветления вокруг колоний ряда исследуемых штаммов (Delftia sp. Lp-1, M. extorquens G10, Ancylobacter sp. Osot и Mp. musalis MUSA), образующиеся в результате растворения трикальцийфосфата (рис. 1). Несмотря на отсутствие явно выраженных зон просветления у других культур на агаризованной среде, все исследуемые штаммы на жидкой среде с Са3(РО4)2 растворяли неорганический фосфор. 11 штаммов ме-тилобактерий: M. extorquens штаммы G10 и Ps2, M. nodulans ORS2060, Ancylobacter sp. Osot, Mph. fla-vus Ship, Mv. mays С, Mp. musalis MUSA, Mb. ar-boreus Iva, Mv. menthalis MM, Mv. fructoseoxidans 34, Mp. turkiensis Side1 — растворяли трикальцийфос-фат с образованием в культуральной жидкости от 120 до 160 мкг/л растворимых форм фосфора, тогда как 3 штамма: Delftia sp. Lp-1, Methylopila spp. штаммы Sb и Minsk, — показали бльшую фосфат-солюбилизирующую активность с концентрацией растворимых форм фосфора от 230 до 280 мкг/л (таблица).
Следует отметить, что исследуемые штаммы реализуют разные пути С1-метаболизма и, соответственно, имеют разные скорости роста. Титр клеток в процессе культивирования увеличивался с 2 х 103—6.4 х 104 при засеве до 2.3 х 104—2 х х 107 КОЕ/мл в конце эксперимента. При росте на полноценной среде с KH2PO4 культуры достигали такой плотности клеток через 2—3 сут. Однако на среде без доступного источника фосфора их рост тормозился, и у всех исследуемых штаммов наблюдали лаг-фазу (2 сут), что, вероятно, объясняется накоплением метаболитов, необходимых для растворения фосфатов. В контроле с полным отсутствием источника фосфора (KH2PO4, Са3(РО4)2) исследуемые метилобактерии не росли. В стерильной среде с Са3(РО4)2 через 7 сут инкубации контрольных колб при 29°С и 150 об/мин растворимые формы фосфора не обнаружены.
Интересно, что Delftia sp. Lp-1, Mb. arboreus Iva, Methylopila sp. Side1, Mp. capsulata штаммы Minsk и Sb, Mp. musalis MUSA, Ancylobacter sp. Osot, Mv. fructoseoxidans 34 накапливали максимальное количество фосфатов к 7 сут роста, тогда как другие метилобактерии (M. extorquens штаммы G10 и Ps2, Mv. menthalis Mm, Mph. flavus Ship,
Рис. 1. Фосфатсолюбилизирующая активность штаммов Delftia sp. Lp-1 (1), M. extorquens G-10 (2), Ancylobacter sp. Osot (3) и Mp. musalis MUSA (4) на агаризованной питательной среде с Саз(РО4)2.
300 250 £ 200
150
Рн 100
50
0
(а)
2 3 4 5 Время, сут
300 250 .5 200
150
Рн 100
50
0 1 2 3 4 5 6 Время, сут
7 8
Рис. 2. Накопление фосфора при культивировании исследуемых штаммов на жидкой питательной среде с Саз(РО4)2: а — Delftia sp. Lp-1 (1), Ancylobacter sp. Osot (2), M. nodulans ORS2060 (3), б — Mp. capsulata Sb (4), Mv. menthalis MM (5), Mv. mays C (6).
1
6
7
M. nodulans ORS2060, Mv. mays С) — к 4 и 7 сут (рис. 2).
Метаболизм метанола сопровождался выделением органических кислот, вследствие чего величина рН в ходе культивирования снижалась с 7.4 до 4.8—5.3 (таблица). При достижении этого
значения рН дальнейший рост культур ингиби-ровался. Ранее энзимологическим методом было установлено, что теШкаШ ММ закисляет среду, образуя муравьиную кислоту (4—7 мМ) из метанола [20]. Образование муравьиной кислоты было обнаружено также при культивировании метанотрофов на метаноле [21]. Методом
ФОСФАТСОЛЮБИЛИЗИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ АЭРОБНЫХ МЕТИЛОБАКТЕРИЙ 31
Солюбилизация фосфатов метилобактериями при росте на среде с метанолом
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.