БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2013, том 30, № 4, с. 271-275
УДК 591.145.2;591.145.3
ФОСФОЛИПАЗЫ а2 из ядов змей блокируют ток,
ВЫЗВАННЫЙ АЦЕТИЛХОЛИНОМ В ИДЕНТИФИЦИРОВАННЫХ
НЕЙРОНАХ Lymnaea stagnalis
© 2013 г. Е. А. Вульфиус1*, Е. В. Горбачева1, В. Г. Старков2, И. Е. Кашеверов2, Т. В. Андреева2, А. В. Осипов2, В. И. Цетлин2, Ю. Н. Уткин2
Институт биофизики клетки РАН, Пущино Московской обл., Институтская ул., д. 3;
*электронная почта: vulfius@gmail.com 2Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 20.03.2013 г.
Фосфолипазы А2 (ФЛА2) — наиболее распространенные в ядах змей белки, играющие существенную роль в поражении жертвы. Содержание ФЛА2 в ядах достаточно высоко. Наряду с ферментативной активностью ФЛА2 обладают и другими видами биологической активности, в том числе нейротоксичностью. Ранее мы обнаружили, что белок битанарин из яда африканской шумящей гадюки Bitis arietans не только способен блокировать ответ нейронов Lymnaea stagnalis на ацетилхолин, но является также активной ФЛА2. В дальнейшем обнаружили, что ФЛА2 из ядов змей двух семейств способны взаимодействовать с никотиновыми холинорецепторами (нХР). ФЛА2 из ядов Vipera ursinii (сем. Viperidae), Naja kaouthia и Bungarus fasciatus (сем. Elapidae) подавляли ток, индуцированный ацетилхолином в идентифицированных нейронах прудовика. Этот эффект проявлялся в диапазоне концентраций ФЛА2 порядка десятков микромолей. Полученные результаты позволяют предположить наличие в молекуле ФЛА2 участка, имеющего сродство к нХР, и возможный вклад блокирования нХР в токсическое действие ФЛА2.
Ключевые слова: фосфолипазы А2, яды змей, никотиновые холинорецепторы, антагонисты, нейроны прудовика.
Б01: 10.7868/80233475513040075
Яды змей содержат большое количество биологически активных соединений, среди которых наиболее представлены фосфолипазы А2 (ФЛА2, фосфатидилхолин-2-ацилгидролазы [ЕС 3.1.1.4]). Они гидролизуют фосфолипиды (преимущественно с ненасыщенными связями) в 8п-2-положении с образованием лизофосфолипидов и ненасыщенных жирных кислот [1, 2]. Продукты гидролиза сильно изменяют физические свойства клеточных мембран и активируют некоторые пути в каскаде биохимических реакций. Этим, по-видимому, объясняется множественность токсических эффектов ФЛА2 в организме жертвы. Однако не всегда удается установить корреляцию между ферментативной активностью и токсическим действием. Полагают, что действие ФЛА2 может зависеть от дополнительных факторов и/или от взаимодействия с другими мишенями.
В результате скрининга полипептидов из ядов змей семейства У1рег1ёае, способных взаимодействовать с никотиновыми холинорецепторами (нХР), мы обнаружили в яде африканской гадюки
Bitis arietans новый белок битанарин, который блокировал ответы идентифицированных нейронов Lymnaea stagnalis на ацетилхолин (АХ) и конкурировал с меченым [1251]-а-бунгаротоксином ([125I]aBgt) за связывание c нХР мышечного и нейронного а7-типа, а также с АХ-связывающим белком (АХСБ) из L. stagnalis [3, 4]. При анализе структуры битанарина мы выявили его сходство (молекулярная масса, число S-S-связей, аминокислотная последовательность N-конца и трип-тических пептидов) с ФЛА2 из ядов других змей семейства Viperidae. Этот белок обладал высокой (1.95 ммоль/мин/мкмоль) фосфолиполитиче-ской активностью, которая сильно зависела от ионов кальция [3], что также характерно для ФЛА2. Мы предположили, что другие ФЛА2 змеиных ядов также могут взаимодействовать с нХР. В настоящей работе это предположение проверено с использованием ФЛА2 из ядов трех видов змей: Vipera ursinii, Naja kaouthia и Bungarus fasciatus. Опыты по влиянию на токи, индуцированные ацетилхолином в нейронах прудовика, и по кон-
AX 3 мкМ
AX 3 мкМ
а
AX 3 мкМ
AX 3 мкМ
AX 3 мкМ
2 с
Контроль 10 мкМ
Отмыв
50 мкМ
Отмыв
AX 3 мкМ AX 3 мкМ AX 3 мкМ AX 3 мкМ AX 3 мкМ AX 3 мкМ
Контроль
1 мкМ
Отмыв
10 мкМ
Отмыв
50 мкМ
AX 3 мкМ
2 с
Отмыв
Рис. 1. Влияние фосфолипаз А2 Vur-PL2 V. ursinii и СМ-II Naja kaouthia на ток, вызванный ацетилхолином (АХ) в двух нейронах Lymnaeastagnalis. а — Ответы нейрона на АХ до обработки (контроль), после 5-мин обработки Vur-PL2 в концентрациях, указанных под экспериментальными записями тока, и после отмывания фермента в течение 10 и 11 мин (средняя и крайняя правая записи соответственно); б — ответы другого нейрона на АХ до обработки (контроль), после 5-мин обработки фосфолипазой СМ-II и после отмывания полипептида в течение 17, 45 и 16 мин (третья, пятая и седьмая записи соответственно) после воздействий СМ-II.
куренции с [125I]aBgt за связывание с нХР двух подтипов подтвердили предположение о взаимодействии ФЛА2 с нХР. Эффективность взаимодействия ФЛА2 с нХР невысока и наблюдается при концентрации 1—50 мкМ, что близко к параметрам связывания ФЛА2 с фосфолипидами (1— 100 мкМ) [1].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали очищенные ФЛА2 змей, полученные нами как описано ранее [5, 6], а также ацетилхолин иодид, проназу E (из Strepto-mycesgriseus), Trizma-HCl, EGTA, HEPES, хлориды щелочных и щелочноземельных металлов фирмы Sigma-Aldrich (США).
Опыты проводили на идентифицированных гигантских нейронах (RP 1,2,3 и LP1,2), изолированных из правого и левого париетальных ганглиев прудовика L. stagnalis после их мягкой ферментативной обработки в растворе проназы (3.5 мг/мл, 45 мин при комнатной температуре). Для оценки действия АХ использовали метод регистрации тока в условиях фиксации мембранного потенциала и внутриклеточной перфузии при постоянном протоке через камеру раствора состава: NaCl 92 мМ, KCl 1.6 мМ, BaCl2 2 мМ, MgCl2 1.5 мМ, Trizma-HCl 4 мМ, pH 7.6. Стандартный Са2+ в наружном растворе полностью заменяли на Ва2+, чтобы ингибировать фосфолипазную активность и исключить действие испытываемых фос-
фолипаз на липиды мембраны. Состав внутриклеточного раствора: CsCl 95 мМ, CaCl2 0.3 мМ, HEPES 10 мМ, EGTA 2 мМ, pH 7.2. АХ апплици-ровали (4-секундные импульсы с интервалами не меньше 6 мин) на всю поверхность нейрона при остановленном протоке наружного раствора. Ток регистрировали, оцифровывали и анализировали с помощью усилителя AM-Systems (США), ЦАП-АЦП Digidata 1200 B и пакета программ pClamp 6.0 (Axon Instruments, США). Растворы фосфоли-паз вводили в камеру при остановленном протоке на 5 мин. Действие оценивали по изменению максимального значения тока в ответ на АХ по сравнению со средним из амплитуды тока до воздействия и после длительного отмывания вещества.
Взаимодействие ФЛА2 с мембранами электрического органа ската Torpedo californica, содержащими нХР мышечного типа (1.25 нМ токсин-свя-зывающих сайтов), клетками линии GH4C1, трансфицированными а7 нХР человека (0.4 нМ токсин-связывающих сайтов), и АХСБ L. stagnalis (2.4 нМ) проводили как описано в работе [3]. Препараты, содержащие нХР или АХСБ, инкубировали в течение 90 мин с ФЛА2, затем добавляли [125I]aBgt (0.1—0.2 нМ) и инкубировали смесь еще 5 мин. После этого фильтровали через стеклянные фильтры GF/C (Whatman, Kent, Англия) в случае мембран Torpedo и клеток GH4C1 или через два слоя бумажных фильтров DE-81 в случае АХСБ. После промывки радиоактивность, свя-
ФОСФОЛИПАЗЫ а2 из ядов змей блокируют ток
273
завшуюся на фильтрах, определяли с помощью гамма-счетчика Wallac 1470 WIZARD® Gamma Counter (PerkinElmer). Уровень неспецифического связывания определяли после предварительной инкубации мембран, клеток или раствора АХСБ в присутствии 10 мкМ а-кобратоксина N. kaouthia в течение 150 мин.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В условиях внутриклеточной перфузии раствором, симметричным наружному по концентрации хлора, идентифицированные нейроны прудовика отвечали на АХ входящим С1--зависимым током при поддерживаемом потенциале —50^—60 мВ [7] (рис. 1). Этот ток подавлялся а-нейротоксинами змей — классическими блокаторами нХР мышечного и а7-типов [8]. Мы проверили действие классических ФЛА2: СМ-11 N. kaouthia [9], Уиг-PL2 V. ursinii [6] и КБ1У1 B. fasciatus [10]. Все три испытанные ФЛА2 снижали амплитуду АХ-зави-симого тока. Vur-PL2 V. ursinii подавляла ответы на АХ, начиная с концентрации около 10 мкМ, ее действие было быстро обратимым при отмывании (рис. 1а). СМ-11 из яда кобры N. kaouthia действовала сильнее, и ответ восстанавливался значительно медленнее, особенно после применения несколько раз и/или в высоких концентрациях (рис. 1б). На рис. 2 представлена концентрационная зависимость блокирования тока, вызванного АХ, двумя ФЛА2. Концентрация, при которой ток уменьшается вдвое (1С50), для Vur-PL2 была несколько больше 50 мкМ, для СМ-11 из N. kaouthia 1С50 оказалась примерно вдвое меньше — 28.5 мкМ. ФЛА2 из яда B. fasciatus в концентрации 10— 40 мкМ также проявляла ингибирующий эффект.
Нами также была проверена способность Уиг-PL2 V. ursinii конкурировать с [1251]аБ§1 за связывание с нХР мышечного типа в мембранах электрического органа ската T. californica, с а7 нХР человека, экспрессированным в клетках линии GH4C1, и с АХСБ L. stagnalis. Как показали проведенные эксперименты ФЛА2 V. ursinii способна конкурировать с [1251]аБ§1 за связывание с указанными рецепторами (рис. 3), проявляя при этом невысокое сродство. Так, величины 1С50 составили 29 ± 2, 60 ± 12 и более 100 мкМ для а7 нХР, АХСБ L. stagnalis и нХР мышечного типа соответственно.
Определенные в данной работе величины 1С50 указывают на умеренное сродство ФЛА2 к нХР. Однако они близки к величинам 1С50, установленным для слабого нейротоксина ^ТХ из яда кобры при блокировании вызванного АХ тока в нейронах прудовика, и всего в несколько раз выше 1С50, полученных для короткого а-нейроток-сина МТП в аналогичных условиях [8]. Учитывая высокое процентное содержание ФЛА2 в яде змей [10, 11], мы полагаем, что действие ФЛА2 как ан-
1.0 -
¡S 0.9 -
&
J 0.8 -
й 0.7 -
£ ^ 0.6 -
0.5 .......
IC50 > 50 мкМ
........' ........' ........I .........
1.0 - 0.9
Ц
о &
S 0.8
0.01 0.1 1 10 [Vur-PL2], мкМ - б
100
0.7
0.6
0.5
IC50 28.5 ± 12.2 мкМ nH = 0.67
......... ......... ......... .........
0.01 0.1 1 10
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.