ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 412, № 4, с. 555-557
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.2, 572152.27
ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ПРОТЕИНКИНАЗЫ МАК-У В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
© 2007 г. И. В. Коробко, Е. В. Коробко, Н. Н. Нинкина, В. Л. Бухман, С. Л. Киселев
Представлено академиком Г.П. Георгиевым 07.07.2006 г. Поступило 07.07.2006 г.
Фосфорилирование, которое осуществляется с высокой специфичностью протеинкиназами, является одним из основных способов регуляции активности белков в эукариотических клетках. При этом активности протеинкиназ в клетке находятся под жестким пространственным и временны м контролем. Эта регуляция может осуществляться различными способами, включающими непосредственно контроль ферментативной активности каталитического протеинкиназного домена, регуляцию его доступности для молекулы субстрата, а также контроль внутриклеточной локализации протеинкиназ. Все эти способы контроля активности протеинкиназ могут также регулироваться фосфорилированием определенных аминокислотных остатков как в каталитическом домене протеинкиназ, так и вне его [1]. Таким образом, важность фосфорилирования активности протеинкиназ в контроле диктует необходимость исследования этого процесса для понимания механизмов их действия.
Ранее нами была впервые описана АМРК-по-добная серин-треониновая протеинкиназа позвоночных МАК^ [2, 3]. Функциональная роль этой протеинкиназы и механизмы ее регуляции в клетке и в организме остаются до сих пор мало изученными, хотя полученные немногочисленные данные позволяют предположить ее участие в таких фундаментальных процессах, как контроль клеточного цикла и пролиферации, развитие организма и функционирование нервной системы [3-8]. Анализ аминокислотных последовательностей протеинкиназ МАК^ различных организмов выявил в ее последовательности несколько эволюционно консервативных сайтов возможного фосфорилирования остатков серина и треонина протеинкиназами РКА, РКС, казеин-
киназами 1 и 2, lkbl, а также пролин-направленны-ми протеинкиназами как внутри каталитического домена, так и вне его. Цель настоящего исследования - выяснение возможности фосфорилирования MAK-V другими протеинкиназами, что может являться одним из механизмов регуляции ее функциональной активности в клетке.
Исследование статуса фосфорилирования эндогенно продуцируемого белка MAK-V на настоящий момент является невозможным в силу отсутствия антител, способных детектировать эндогенный белок MAK-V методом вестерн-блот-анализа. Поэтому для анализа фосфорилирования протеинкиназы MAK-V в клетке был использован мониторинг фосфорилирования экзогенно продуцируемого в клетках белка. Нами созданы экспрессионные плазмиды для продукции протеинкиназы MAK-V с FLAG-эпитопом на C-конце (pCMV-MAK-V-FLAG), а также ее мутантов с удаленным убиквитин-ассоциированным доменом (удалены аминокислоты 346-383, pCMV-MAK-VAUBA-FLAG), с заменой каталитического лизина-91 на аргинин (каталитически неактивный мутант, pCMV-MAK-V(K91R)-FLAG) и с заменой лейцина-301 на пролин (мутант, дефектный по центросомальной и ядерной локализации, pCMV-MAK-V(L301P)-FLAG [7]. Экспрессионные плазмиды были трансфицированы в клетки линии COS-7, лизаты которых использовали для аффинной очистки белков с FLAG-эпитопом.
Клетки собирали через 24 ч после трансфекции и лизировали при 4°C в буфере для лизиса (20 мМ трис-HCl, pH 7.5, 100 мМ NaCl; 1% Nonident P-40, 0.5% Trition-X100, 1 мМ MgCl2, 0.2 мМ EGTA, 1x ингибиторы протеаз Complete Mini EDTA-Free ("Roche", Швейцария), 1x ингибиторы фосфатаз Phosphatase Inhibitor Cocktail I and II ("Sigma", США)). Лизаты после центрифугирования (10 мин при 4°C и 4500 об/мин) инкубировали с анти-FLAG-M2 аффинным гелем 2 ч при 4°С с перемешиванием и промывали 3 раза буфером для лизиса. Связавшиеся с аффинным гелем белки элюировали добавлением буфера для нанесения на Ds-Na-ПААГ с последующим кипячением. Белки разделяли в 10%-ном Ds-Na-ПААГ и фосфорилированные
Институт биологии гена Российской академии наук, Москва Центр медицинских исследований Университета Осло в России, Москва Университет Кардиффа, Великобритания
556
КОРОБКО и др.
MM, кДа (a) MM, кДа (б)
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
P - Ser P - Thr
Рис. 1. Анализ фосфорилирования белка MAK-V-FLAG и его мутантов в клетках линии COS-7. а - aнти-FLAG-M2-антитела, б - антифосфосериновые (P-Ser) или антифосфотреониновые (P-Thr) антитела использовали для вестерн-блоттинга белков, иммунопреципитированных из лизатов клеток линии COS-7, транзиторно продуцирующих белок MAK-V-FLAG (1) или его мутантные формы ДиВА (2), L301P (3), K91R (4), и из лизатов нетрансфицирован-ных клеток (5). Положения маркёров молекулярных масс отмечены слева. Стрелками на а и б отмечены белковые полосы, окрашиваемые только в лизатах клеток, продуцирующих белок MAK-V-FLAG или его мутантные формы. Звездочками (а) отмечены выявляемые при вестерн-блоттинге цепи aнти-FLAG-M2-моноклонaльныx антител, частично элюируемые с аффинного матрикса.
белки идентифицировали с помощью антифос-фосериновых и антифосфотреониновых антител ("Zymed", США). Для детекции MAK-V и ее му-тантных вариантов с FLAG-эпитопом использовали моноклональные анти-FLAG-M2-антитела ("Sigma", США).
Как видно на рис. 1а, в лизатах трансфициро-ванных клеток анти-FLAG-M2-антитела детектировали белки ожидаемой для MAK-V-FLAG и его мутантных вариантов MAK-V (K91R)-FLAG и MAK-V(L301P)-FLAG молекулярной массы (около 80 кДа), а также белок несколько меньшей по сравнению с ними молекулярной массы в случае использования лизатов клеток, экспрессирующих MAK-VAUBA-FLAG, в котором удалены 38 аминокислот. При анализе тех же образцов с анти-фосфосериновыми антителами (рис. 16), кроме неспецифически сорбированных аффинным мат-риксом фосфобелков, были идентифицированы фосфобелки, присутствующие только в лизатах трансфицированных клеток. Подвижности и относительные количества детектируемых в этом случае белков совпадали с подвижностями и относительными количествами белков, детектированными с помощью анти-FLAG-антител. Это позволило сделать вывод, что белки MAK-V-FLAG, MAK-V(K91R)-FLAG, MAK-V(L301P)-FLAG и MAK-VAUBA-FLAG фосфорилируются в клетке по остаткам серина. При этом, так как не наблюдалось различий в фосфорилировании MAK-V и ее мутанта с нарушенной внутриклеточной локализацией и каталитически неактивного мутанта (K91R), можно сделать вывод о том, что наблюдаемое фосфорилирование MAK-V по остаткам се-
рина не зависит от ядерной и центросомальной локализации MAK-V, а также не является авто-фосфорилированием, а опосредовано другими киназами. Аналогичный эксперимент с использованием антифосфотреониновых антител не выявил фосфорилирования MAK-V и ее мутантных вариантов по остаткам треонина (рис. 16).
При транзиторной экспрессии в клетках эука-риот протеинкиназа MAK-V характеризуется склонностью к формированию агрегатов в результате продукции большого количества белка [7]. Для демонстрации того, что фосфорилирование транзиторно продуцируемого белка MAK-V в клетках не является артефактным, нами были получены стабильно трансфицированные клоны клеток линии PC12TetOn с тетрациклинрегулиру-емой экспрессией белка MAK-V-FLAG. Иммуноци-тохимический анализ показал, что в выбранном для дальнейшей работы клоне белок MAK-V-FLAG не формирует агрегатов и характеризуется описанной ранее для транзиторно продуцируемого белка [7] центросомальной локализацией (данные не приведены). Клон клеток PC12TetOn был использован для анализа фосфорилирования белка MAK-V. Для этого фосфобелки были аффинно изолированы с помощью набора для очистки фосфобелков (PhosphoProtein Purification Kit, "QIAGEN", Германия), и пропорциональные аликвоты фракций фосфорилированных и нефосфорилирован-ных белков анализировали на присутствие белка MAK-V-FLAG с анти-FLAG-антителами. В результате анализа было установлено, что значительная часть белка MAK-V-FLAG, продуцируемого клетками клона PC12TetOn, присутствует во фракции
ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ПРОТЕИНКИНАЗЫ MAK-V
557
Р- Р+ JL_ + - +- + -
Рис. 2. Анализ фосфорилирования белка MAK-V-FLAG в клетках PC12TetOn с тетрациклинрегулируе-мой экспрессией MAK-V-FLAG. Вестерн-блоттинг с анти-FLAG-M2-антителами фракций фосфорилиро-ванных (P+) и нефосфорилированных (P-) белков клеток PC12TetOn с индуцированной (+) или неинду-цированной (-) экспрессией белка MAK-V-FLAG.
фосфобелков (рис. 2). Эти данные подтверждают присутствие фосфорилированной формы белка MAK-V в клетке.
Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что протеинкиназа MAK-V фосфо-рилируется в клетке другими, пока неидентифи-цированными протеинкиназами. Известно, что активности близкородственных MAK-V-протеин-киназ действительно подвержены регуляции путем их фосфорилирования. Так, каталитическая активность большинства AMPK-подобных протеинкиназ млекопитающих регулируется фосфори-лированием консервативных остатков треонина и серина в T-петле каталитического домена [9]. Кроме фосфорилирования в каталитическом домене, непосредственно влияющего на активность, функции AMPK-подобных протеинкиназ могут регулироваться и фосфорилированием вне него. Примером такой регуляции является фосфорили-рование протеинкиназы Par-1b в C-концевой области, которое приводит к ингибированию мем-
бранной локализации Par-1b, существенной для ее функционирования [10, 11]. Возможно, что и фос-форилирование MAK-V в клетке является одним из механизмов регуляции ее активности, хотя это предположение требует дальнейших исследований и экспериментальных подтверждений.
Работа была выполнена при поддержке грантов РФФИ, а также INTAS Young Scientist Fellowship и The Wellcome Trust Short-Term Travel Grant для И.В. Коробко.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Caplan A. // Sci. STKE. 2005. V. 272. P. tr7.
2. Коробко И.В, Кабишев A.A., Киселев С.Л. // ДАН. 1997. Т. 354. № 4. С. 554-556.
3. Korobko I.V., Korobko E.V., Kiselev S.L. // Mol. and Gen. Genet. 2000. V. 264. P. 411-418.
4. Gardner HP, Wertheim G.B.W, Ha S.I. et al. // Genomics. 2000. V. 127. P. 46-59.
5. Gardner H P, Belka G.K, Wertheim G.B .W. et al. // Development. 2000. V. 127. P. 4493-4
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.