БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 3, с. 196-202
УДК 576.311.5+577.352.236+577.352.334+581.1
ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИЙ РЕГУЛЯТОР РОСТА РАСТЕНИЙ: УСТОЙЧИВОСТЬ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ И ЖИВОТНЫХ К СТРЕССОВЫМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ
© 2008 г. И. В. Жигачева, Е. Б. Бурлакова, А. Г. Шугаев*, И. П. Генерозова*,
С. Г. Фаттахов**, А. И. Коновалов**
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 119334 Москва, ул. Косыгина, 4; факс (495)137-41-01; электронная почта: zhigacheva@mail.ru
* Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва, ул. Ботаническая, 35; тел: (495)903-93-40; электронная почта: ag-shugaev@ippras.ru ** Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова РАН Казанского научного центра, Казань; факс (8432)73-18-72; электронная почта: mshulaeva@iopc.knc.ru Поступила в редакцию 29.05.2007 г.
После доработки 15.10.2007 г.
Добавление в среду инкубации митохондрий, выделенных из печени крыс или из корнеплодов сахарной свеклы, фосфорорганического регулятора роста растений (препарата "Мелафен") в концентрации 4 х 10-12 М приводит к увеличению максимальной скорости окисления NAD-зависимых субстратов. Препарат также активирует перенос электронов при окислении сукцината митохондриями печени крыс. Однако скорость окисления этого субстрата митохондриями, выделенными из корнеплодов сахарной свеклы, остается неизменной. Митохондрии запасающих органов растений характеризуются довольно низкой скоростью окисления NAD-зависимых субстратов. Стимулируя повышение активности NAD-зависимых дегидрогеназ, мелафен, по-видимому, способствует активации энергетических процессов в клетке и обеспечивает высокую энергию прорастания семян, проявляя адаптогенные свойства. Препарат не влияет на уровень флуоресценции продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в митохондриях, не подвергнутых стрессовым воздействиям, и в 1.5-2 раза снижает уровень флуоресценции продуктов ПОЛ в мембранах митохондрий печени крыс, подвергнутых холодовому стрессу, и в искусственно "состаренных" митохондриях из корнеплодов сахарной свеклы. Кроме того, мелафен увеличивает скорость переноса электронов на конечном участке дыхательной цепи митохондрий как растительного, так и животного происхождения, что, в свою очередь, может снижать уровень ПОЛ. Полученные данные позволяют сделать предположение об антистрессовых свойствах препарата "Мелафен".
Устойчивость клеток растительного и животного происхождения к действию неблагоприятных факторов внешней среды определяется как специфическими реакциями, зависящими от особенностей воздействия, так и неспецифическими реакциями, возникающими при действии стрессовых факторов. К таким специфическим реакциям относится, например, биосинтез аквапоринов в условиях водного дефицита, разобщение транспорта электронов и фосфорилирования, активация альтернативных путей окисления в дыхательной цепи митохондрий животных и растений, подвергнутых холодовому стрессу. К неспецифическим реакциям относится изменение физико-химических свойств биологических мембран [1, 2]. Стрессовые воздействия изменяют соотношение насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, при этом прооксидант-но-антиоксидантное равновесие смещается в сторону активации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) [3, 4]. Можно предположить, что препараты, способные влиять на структурные характеристики биологических мембран, снижая со-
держание продуктов ПОЛ и придавая мембранам большую структурную и функциональную стабильность, будут обладать антистрессовыми свойствами. В качестве такого препарата был выбран регулятор роста растений мелафен, который представляет собой меламиновую соль бис(оксиме-тил)фосфиновой кислоты [5]. Выбор мелафена в качестве объекта исследования объясняется большим вниманием, которое уделяется изучению механизмов действия регуляторов роста растений. Обработка растений регуляторами роста позволяет ускорить образование генеративных органов, усилить или затормозить рост и т.п. [6, 7], а также повысить устойчивость к абиотическому стрессу [8-12].
Предпосевная обработка семян зерновых, зернобобовых, пасленовых сельскохозяйственных культур мелафеном в концентрации 10-7-10-8% повышает энергию прорастания на 5-25%, увеличивает урожайность и вегетативную массу растений, повышает пищевую ценность продукции [13, 14], а
также содержание хлорофилла и каротиноидов в среднем на 15-25% [15]. Препарат стимулирует дыхание растительных клеток, повышает эффективность циклического фосфорилирования и увеличивает теплопродукцию [15].
Исходя из этих данных, можно предположить, что влияние мелафена на процессы жизнедеятельности растительной клетки связано с изменением физико-химического состояния мембран и активности ассоциированных с мембранами ферментов, прежде всего ферментов дыхательной цепи митохондрий. Дыхательная цепь митохондрий растений и животных имеет сходную организацию, основные различия касаются лишь КАБИ-дегидроге-назного участка и СК-резистентного переноса электронов [16]. В связи с этим интересно было выяснить, отразятся ли эти различия на воздействии мелафена на процессы транспорта электронов в дыхательной цепи митохондрий растений и животных и эффективность окислительного фосфорилирования. Поскольку многие виды стресса приводят к повышению уровня активных форм кислорода, вызывающих активацию процессов ПОЛ [3, 4, 17], мы исследовали влияние препарата на уровень ПОЛ в мембранах митохондрий из печени крыс и митохондрий из корнеплодов сахарной свеклы, подвергнутых стрессовым воздействиям - холодо-вому стрессу для крыс и искусственному "старению" для митохондрий из корнеплодов сахарной свеклы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Работу проводили на митохондриях, выделенных из корнеплодов сахарной свеклы [18] и из печени белых крыс линии Вистар [19].
Изучали влияние мелафена на уровень ПОЛ в митохондриях в различном функциональном состоянии. Использовали митохондрии, выделенные из растений и животных, находящихся в стандартных условиях, митохондрии животных, подвергнутых холодовому стрессу, и искусственно "состаренные" митохондрии растений (т.е. после 5 ч хранения при 10°С).
Крыс подвергали холодовому стрессу, выдерживая их в воде с температурой 2°С до тех пор, пока их ректальная температура не снижалась с 37.6 до 33°С. Перед декапитацией крыс содержали в течение 30 мин при комнатной температуре. Митохондрии из печени контрольных и подвергнутых холодовому стрессу животных, а также свежевы-деленные или искусственно "состаренные" (после 5 ч хранения при 10°С) митохондрии сахарной свеклы в течение 30 мин инкубировали с 4 х 10-122 х 10-7 М мелафена или без этого препарата. Среда инкубации митохондрий печени содержала 0.25 М сахарозу и 10 мМ трис-ИС1, рИ 7.5 (4°С). Митохондрии, выделенные из корнеплодов сахарной свек-
лы, инкубировали при 4°C в среде, содержащей 0.4 М сахарозу, 20 мМ HEPES-трис-буфер (рН 7.2). Уровень ПОЛ оценивали флуоресцентным методом [20], используя спектрофлуориметр "Hitachi MPF-4" (Япония). Экстракцию липидов из мембран митохондрий проводили в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком. Липиды экстрагировали из 3-5 мг митохондриального белка смесью хлороформ-метанол = 2 : 1 (по объему). Соотношение митохондрии : смесь хлороформ-метанол = 1 : 10.
Митохондрии гомогенизировали в течение
1 мин при температуре 10°C. Затем к гомогенату добавляли равный объем дистиллированной воды, быстро смешивали и переносили в 12-мл центрифужные стаканы. (Промывание водой необходимо для удаления флавиновых компонентов, имеющих максимум флуоресценции в области 520 нм.) Центрифугировали в течение 5 мин при 600 g.
Отбирали 1 мл хлороформенного (нижнего) слоя и добавляли 0.1 мл метанола. Флуоресценцию регистрировали в 10 мм кварцевых микрокюветах объемом 1.4 мл на спектрофлуориметре "Hitachi MPF-4". В качестве контроля использовали 1 мл хлороформа, к которому добавляли 0.1 мл метанола. Перед измерениями регистрировали стандартную флуоресценцию гуанидинсульфата (1 мкг/мл в растворе 0.1 н. серной кислоты), которую принимали за 60 ед. флуоресценции. Результаты выражали в отн. единицах флуоресценции на 1 мг митохондриального белка.
Оценивали также влияние препарата на скорость переноса электронов на конечном цитохро-моксидазном участке дыхательной цепи.
Скорости дыхания митохондрий из печени крыс и из корнеплодов сахарной свеклы, регистрировали кислородным электродом типа Кларка, используя полярограф LP-7 (Чехия).
При определении скорости переноса электронов в дыхательной цепи митохондрий печени использовали среду инкубации следующего состава: 0.25 М сахароза, 10 мМ трис-HCl, 2 мМ MgSO4,
2 мМ KH2PO4, 10 мМ KCl (рН 7.5) (28°С). Среда инкубации митохондрий сахарной свеклы содержала 0.4 М сахарозу, 20 мМ HEPES-трис-буфер (рН 7.2), 5 мМ КН2РО4, 4 мМ MgCl2, 0.1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 28°С.
Изучали также влияние мелафена на скорость прорастания семян гороха в обычных условиях и в условиях недостаточного увлажнения. Семена гороха промывали 0.1% раствором хозяйственного мыла и 0.01% раствором KMnO4. Контрольные семена помещали на 60 мин в воду, а опытные - на 30 мин в 10-7% раствор мелафена, а затем на 30 мин в воду. После этого 200-240 семян раскладывали на влажной фильтровальной бумаге в закрытых кюветах и помещали в термостат при температуре 22°С. Спустя 1 сут половину семян из
Таблица 1. Максимальные скорости окисления субстратов в дыхательной цепи митохондрий печени крыс при инкубации митохондрий с препаратом мелафен
Субстрат Vo VFCCP ^мелафен Мелафен, М
Глутамат + малат 19.8 ± 0.3 62.6 ± 5.4 77.2 ± 5.2 2 х 10-12
» 19.0 ± 0.7 60.2 ± 0.8 84.1 ± 5.3 4 х 10-12
» 14.0 ± 0.3 56.0 ± 1.2 40.0 ± 1.0 2 х 10-5
Сукцинат 17.7 ± 1.5 61.4 ± 0.9 96.8 ± 3.2 4 х 10-12
» 19.1 ± 0.8 69.8 ± 2.1 86.5 ± 3.0 2 х 10-7
» 21.3 ± 0.5 67.8 ± 0.3 46.7 ± 0.5 2 х 10-5
Примечание. Среда инкубации содержала: 0.2 М сахарозу, 10 мМ трис-HCl, 2 мМ MgSO4, 2 мМ KH2PO4, 10 мМ KCl, 4 мМ глутамат, 1 мМ малат или 5 мМ сукцинат, pH 7.5. Дополнительные добавки: 10-6 М FCCP. Число независимых экспериментов равно 5. Скорость дыхания в табл. 1-4 приведена в нмоль 02/мг белка
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.