m
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, M 11, с. 858 - 867
УДК 547.963.32.07:577.113.6:554
ФОТОАФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ В КОМПЛЕМЕНТАРНОМ КОМПЛЕКСЕ © 1995 г. Т. С. Годовикова#, М. В. Березовский*, Д. Г. Кнорре
Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. Лаврентьева, 8; *Новосибирский государственный университет, 630090, Новосибирск, ул. Пирогова, 2 Поступила в редакцию 15.09.94 г. После доработки 17.07.95 г.
Изучено внутрикомплексное фотохимическое взаимодействие фотоактивных производных R-CONH(CH2)3NH-pGATACCAA, где R = и-азидотетрафторфенил (I) или 2-нитро-5-азидофенил (II) и 5'-фосфо-я-азидоанилида pGATACCAA (III) с мишенью - олигонуклеотидом *pGGTATCp (IV) и его производными *pGGTATCp-NH(CH2)3NHX, где X = H (V), Phe (VI) или Lys (VII). По данным электрофореза, фотореагент (I) образует ковалентные фотоаддукты как с соединением (IV), так и с производными (VI) - (VII). В случае реагента (II) фотосшивка наблюдается только с мишенями (V) - (VII), включающими в себя алифатические аминогруппы. При облучении дуплексов, образованных фотореагентом (III) с мишенями (V) - (VII), процесс сопровождается отщеплением олиго-нуклеотидного фрагмента реагента от продукта фотомодификации. Обсуждается возможный механизм данного отщепления.
Ключевые слова: производные олигонуклеотидов, фотоаффинная модификация, ароматические азиды, производные аминокислот .
Производные олигонуклеотидов, несущие ре-акционноспособные группы, нашли широкое применение для специфической модификации нуклеиновых кислот в районе участков мишени, комплементарных олигонуклеотиду[1], и в качестве аффинных реагентов для модификации белков, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами [2]. Уже накоплен значительный материал по специфической модификации такими производными ферментов, катализирующих биосинтез нуклеиновых кислот - ДНК- и РНК-полимераз [3, 4], белков в составе рибосом [5] и хроматина [6], специфических мембранных рецепторов [7] (например, белка СБ4, ответственного за первичное взаимодействие Т-лимфоцитов с вирусом иммунодефицита человека [8]), некоторых белков сыворотки крови [9].
Наиболее перспективным представляется использование функциональных групп, способных к фотохимической модификации мишени, поскольку, во-первых, они, как правило, инертны в отсутствие облучение и могут быть активированы только после формирования специфических комплексов, а во-вторых, их активация может
Используемые сокращения: *р - 132Р]фосфат. Префикс "с!" ("дезокси") в аббревиатуре олигодезоксинуклеотидов и их производных опущен. # Автор для переписки.
быть осуществлена за очень короткое время, что открывает перспективу исследования динамики процессов, происходящих при белково-нуклеино-вом узнавании. Среди соединений с такими группами большой интерес вызывают ароматические азиды, которые при фотолизе генерируют активные нитрены [10]. Однако, несмотря на большое число работ с использованием фотоаффинных реагентов на основе различных азидов, до сих пор не проводилось систематического исследования фотоактивных групп для модификации белков с целью оптимизации структуры таких реагентов. Мало внимания уделялось также изучению продуктов аффинной модификации - определялись только природа и локализация поврежденного аминокислотного остатка [И].
Настоящая работа посвящена сопоставлению модифицирующих свойств олигонуклеотидных производных трех ароматических азидов, часто используемых при создании реакционноспособ-ных производных олиго- и мононуклеотидов -«-азидоанилина, я-азидотетрафтор- и 2-нитро-5-азидобензойных кислот [1,2]. Эти фотореагенты существенно различаются по фотохимическим свойствам, поскольку при облучении УФ-светом они генерируют разные активные промежуточные частицы: для п-азидотетрафторбензоильно-го остатка характерно образование синглетного
5' 3'
*pGpGpTpApTpCp
5' 3'
*pGpGpTpApTpCp-NH(CH2)3NH-AA
ApApCpCpApTpApGp-NH(CH2)3NHCO-R ApApCpCpApTpApGp-NH
(iv)
(v) - (vii) (I), (II)
(III)
AA = H AA = -COCHCH2-Ph AA = -COCH(CH2)4NH2
(V)
I
nh2
(Phe) (vi)
I
NH2 (Lys)
(vii)
F F
Схема 1.
нитрена [12, 13], для 2-нитро-5-азидобензоильно-го - триплетного [14]. Образующийся при облучении /г-азидоанилина и его производных нитрен в водных растворах практически мгновенно превращается в производные /г-бензохинондиимина [15, 16].
Мы использовали специальную модельную систему, позволяющую проводить сравнительный анализ внутрикомплексного взаимодействия арилазидных производных олигонуклеотидов с нуклеиновыми кислотами и с функциональными группами белков. Модель состоит из производных двух комплементарных олигонуклеотидов, одно их которых является реагентом, а другое -мишенью модификации (схема 1). У реагента к 5'-концевому фосфату непосредственно или через спейсер присоединена арилазидная группа. У мишени к З'-концевому фосфату олигонуклео-тида (IV) через 1,3-диаминопропановый спейсер присоединен аминокислотный остаток.
Среди аминокислот выбраны фенилаланин и лизин, которые нередко участвуют в белково-нук-леиновых взаимодействиях. Кроме того, е-амино-группа лизина в щелочной среде может играть роль сильного нуклеофильного центра.
Ранее [16, 17] нами было показано, что в ходе облучения и-азидоанилин и у-я-азидоанилид АТР превращаются в n-бензохинондиимин и у-л-бензо-хинониминоимид АТР, которые быстро и количественно взаимодействуют с соединениями, имитирующими функциональные группы белков: |3-меркаптоэтанолом, изопропиламином, имида-золом. В настоящей работе показано, что анало-
гичные превращения происходят с лизином. Из изменения УФ-спектра /г-азидоанилина в ходе облучения в воде (рис. 1) видно, что вц процессе фотолиза накапливается продукт с характерным для /г-бензохинондиимина разрешенным спектром в УФ-области [17]. Добавление к облученному раствору 1 М раствора лизина приводит к быстрому исчезновению /г-бензохинондиимина и образованию за 2.5 мин продукта с совершенно другим спектром. Такой же спектр регистрируется при облучении раствора, содержащего одновременно /1-азидоанилид и 1 М лизин (рис. 1, 2). Идентификация продукта превращения лизина в данной работе не предусматривалась и будет предметом дальнейших исследований.
Соединение (V) синтезировали из олигонукле-отида и 1,3-диаминопропана согласно [18]. Производные (VI) и (VII) получали ацилированием конъюгата (V) по алифатической аминогруппе М-оксисукцинимидными эфирами соответствующих аминокислот с защищенными остатком СОСР3 аминогруппами. После ионообменной хроматографии аминогруппы деблокировались 12% водным аммиаком и конечный продукт очищался хроматографией на смоле с обращенной фазой. Соединения (I) и (II) получали аналогичным образом из олигонуклеотида, в который 1,3-диаминопропановый спейсер был введен по 5'-концевому фосфату. Бензоилирование проводилось с помощью 1Ч-оксисукцинимидных эфиров соответствующих азидобензойных кислот.
Соединение (III) получали фосфорилировани-ем /г-азидоанилина фосфо-Ы-метилимидазолидом
220 250 310 400 нм
Рис. 1. Электронные спектры поглощения в воде 10 5 М «-азидоанилина (/) и реакционной смеси, образующейся при его облучении светом X 303 - 365 нм в течение 20 (2), 40 (3), 60 (4), 120 (5), 180 с (б); через 2 мин после добавления к
смеси (6) 1 М водного раствора L-лизина (7). Интенсивность света 1.2 х 1015 квант с^1 см~2.
олигонуклеотида в соответствии с работой [18]. Чтобы предотвратить восстановление азидогруп-пы в присутствии трифенилфосфина и 2,2'-дипири-дилдисульфида, /г-азидоанилин добавляли к фос-фо-Ы-метилимидазолиду олигонуклеотида после выделения последнего из реакционной смеси путем осаждения в эфир.
Производные (II) - (VII) индивидуальны по данным ионообменной хроматографии и высокоэффективной обращенно-фазовой хроматографии. Превращение олигонуклеотидов в фосфамиды через промежуточные фосфо-М-метилимидазо-лиды и обработка фосфамидов олигонуклеотидов N-оксисукцинимидными эфирами, как неод-
нократно показано ранее (см., например, [19]), не приводят к каким-либо повреждениям олигонук-леотидной части. Об отсутствии таких повреждений свидетельствует также совпадение УФ-спек-тров полученных производных в области до 300 нм со спектрами исходных олигонуклесгидов. В спектре соединения (II) наблюдается характерное плечо с максимумом 334 нм, что указывает на присоединение к олигонуклеотиду остатка 2-нит-ро-5-азидобензойной кислоты. О наличии в производных (I) - (III) гидрофобных арилазидных остатков свидетельствует тот факт, что производные (I) и (II) элюируются с обращенной фазы при более высокой концентрации ацетонитрила по
Л 220_ 250 300 400 нм
i i---—-1-—-—-1-1---
46
39
32
v х 103, см 1
Рис. 2. Электронные спектры поглощения 10 5 М л-азидоанилина в 1 М водном растворе ¿-лизина (/) и реакционной
смеси, образующейся при его облучении светом X 303 - 365 нм в течение 20 (2), 50 (3), 110 (4), 170 с (5). Интенсивность
света 1.2 х I О1'5 квант с"1 см"2.
сравнению с соединением (V), а производное (III) -по сравнению с олигонуклеотидом. В ИК-спектрах соединений (I) - (III) наблюдается характерная для азидогруппы полоса поглощения в области 2140-2240 см'1.
Введение в соединение (V) по аминогруппе спейсера N-защищенных аминокислотных остатков должно привести к увеличению суммарного отрицательного заряда. Действительно, после ацилирования наблюдается увеличение времени удерживания продуктов на анионообменной смоле. После удаления трифторацетильных защитных групп обработкой соединений водным раствором аммиака время выхода олигонуклеотидных производных {VI) и (VII) со смолы уменьшается в соответствии с изменением суммарного заряда у соединения (VI) на +1 и у производного (VII) на +2.
Температура плавления (т. пл.) исследуемых комплементарных комплексов, оцененная согласно работе [20] по формуле 4псс + 2пАГ - 3 (псс и лАТ -количество соответствующих комплементарных пар), составляет 15°С. В связи с этим фотомодификацию проводили при 4°С в буфере, содержащем 0.16 М NaC!, 0.02 М Na2HP04, 0.1 мМ EDTA (рН 9), при концентрации производных (IV) - (VII)
(мишени) Ю-6 М. Чтобы обеспеч
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.