МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 6, с. 1059-1066
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ^^^^^^^^ БИОПОЛИМЕРОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ
УДК 577.311
ФОТОАФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ДНК-ЗАВИСИМОЙ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ БАКТЕРИОФАГА Т7 ПРОДУКТОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ РЕАКЦИИ, СОДЕРЖАЩИМ АЗИДОПРОИЗВОДНОЕ UTP
© 2004 г. В. Л. Туницкая, Л. В. Мемелова, Ю. С. Скоблов, С. Н. Кочетков*
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта Российской академии наук,
Москва, 119991 Поступила в редакцию 07.04.2004 г.
Показана возможность применения 5-[3-(£)-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафтор-бензамидо)-пропенил-1]-UTP (N3-TFBP-UTP) в качестве аффинного модификатора ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7 (Т7РНКП). Используемое производное UTP является достаточно эффективным субстратом, замещающим UTP в реакции транскрипции, осуществляемой Т7РНКП. УФ-облучение остановленного реакционного комплекса, полученного в присутствии в реакционной смеси трех из четырех рибонуклеотидных субстратов, позволило зафиксировать ковалентное взаимодействие фермента и продукта реакции, представляющего собой 9-членный олигорибонуклеотид. Выделение и анализ полученного "нуклеотидо-пептида" показало, что объектом ковалентной модификации является пептид Tyr802-Lys826, принадлежащий к консервативному мотиву С в структуре Т7РНКП. Мишенью модификации в составе данного пептида могут являться функционально важные аминокислотные остатки His811 или Asp812.
Ключевые слова: бактериофаг Т7, ДНК-зависимая РНК-полимераза, фотоаффинная модификация, азидопроизводные нуклеотидов.
PHOTO AFFINITY MODIFICATION OF BACTERIOPHAGE T7 DNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE BY THE REACTION PRODUCT CONTAINING THE AZIDO DERIVATIVE OF UTP, by V. L. Tunitskaya, L. V. Memelova, Yu. S. Skoblov, S. N. Kochetkov* (V.A. Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia; E-mail: kochet@eimb.ru). The possibility of using the 5-[3-(£')-(4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzamido)-propenyl-1]-UTP (N3-TFBP-UTP) as the affinity modificator of bacteriophage T7 DNA-dependent RNA polymerase was demonstrated. The UTP derivative used was rather efficient substrate substituting UTP in the transcription reaction performed by the enzyme. The UV treatment of "stopped" reaction complex formed using three of four substrate ribonucleotides, allow to obtain the covalent binding between the enzyme and the reaction product of 9 nucleotides length. The isolation and the analysis of the obtained "nucleotide-peptide" showed that the sequence of modified peptide corresponded to the fragment Tyr802-Lys826, which belonged to the conservative motif C in the enzyme structure. His811 or Asp812 residues belonging to this sequence are most probable targets of the modification.
ДНК- и РНК-полимеразы являются ключевыми ферментами жизнедеятельности различных клеток и вирусов. Кроме того, эти ферменты широко используют в качестве инструментов для генетических и молекулярно-биологических исследований. В связи с этим их структурно-функциональный анализ представляет большой интерес и является предметом исследований во многих лабораториях мира. Несмотря на то, что для многих ДНК- и РНК-полимераз имеются данные рентге-ноструктурного анализа, некоторые контакты между компонентами транскрипционного комплекса, в силу ограниченного времени существования, не всегда могут быть зафиксированы с применением этого подхода. Поэтому аффинная
* Эл. почта: kochet@eimb.ru
модификация фермента, как аналогами нуклео-тидных субстратов, так и с использованием аффинных меток в составе матрицы (промотора) и/или продукта реакции, остается достаточно широко распространенным и весьма информативным методом.
Используя этот подход, ранее мы показали, что при аффинной модификации ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7 (Т7РНКП) аналогом мононуклеотидного субстрата - 5'-и-фторсульфо-нилбензоиладенозином, на определенных стадиях транскрипционного цикла область активного центра фермента сближена с перемычкой между К- и С-концевым доменами [1]. При исследовании взаимодействия Т7РНКП с модифицированными промоторами, содержащими дополнительные остатки рибозы в различных положениях цепи, был зафик-
1059
7*
сирован контакт между положением (+2) нуклео-тидной матрицы и функционально важным аминокислотным остатком Tyr639 в структуре Т7РНКП [2]. Однако для установления контактов, реализующихся в процессе транскрипционного акта между Т7РНКП и 3'-концом продукта реакции, метод аффинной модификации ранее не применяли.
Производные нуклеотидов, содержащие ази-догруппы в различных положениях молекулы, широко используют для аффинной модификации ДНК- и РНК-зависимых ферментов с целью получения информации об участках связывания последних с нуклеотидами [3, 4]. При УФ-облучении азидогруппа может взаимодействовать с боковой цепью практически любой аминокислоты, включая алифатические остатки, недоступные другим аффинным реагентам [5]. Химические структуры аддуктов, образующихся при таких взаимодействиях, очень разнообразны и мало изучены. Помимо природы аминокислоты, они зависят также и от расположения азидогруппы в структуре модификатора [6]. В большинстве случаев такие производные используют для аффинной модификации ДНК- и РНК-зависимых ферментов в виде свободных мононуклеотидов. Для ковалентного связывания этих соединений в активных центрах соответствующих ферментов они, строго говоря, "не обязаны" быть эффективными субстратами реакции: достаточно того, что они обладают сродством к соответствующему центру. Первыми примерами аффинной модификации нуклеотид-полимераз являются исследования активных центров РНК-полимеразы E. coli [7] и РНК полиме-разы II из тимуса теленка [8] с помощью 8-азидо-ATP. Это соединение было применено также для аффинной модификации Т7РНКП [9]. При очевидных достоинствах данного реагента (прежде всего "нулевой" длиной спейсера между реакционным центром и нуклеотидом) его существенным недостатком является чрезмерно высокая реакционная способность, приводящая к широкому спектру неспецифических продуктов реакции. Предложенный М.А. Грачевым и соавт. метод так называемой супераффинной модификации [10], заключающийся во введении радиоактивной метки не в модификатор, а в продукт ферментативной реакции, образованный с участием данного модифицированного звена, в принципе позволил бы избежать регистрации неспецифических продуктов. Однако 8-азидо-АТР является плохим (терминирующим) субстратом, что исключает использование данного метода. В связи с вышеизложенным, в качестве фотоаффинных реагентов для изучения взаимодействия различных ДНК- и РНК-зависимых ферментов с продуктом реакции чаще применяются аналоги нуклеотидов, содержащие азидогруппу в составе заместителя в нуклеиновом основании, обычно в 5-положении пи-римидинового нуклеотида. Ранее фотоаффинные
модификаторы подобного строения применяли для исследования целого ряда ферментов матричного синтеза, однако, ни в одной из работ не было однозначно установлено мишени модификации. При аффинном мечении мультисубъединичной РНК-полимеразы Е. coli задача заключалась в установлении субъединицы, контактирующей с модификатором [11, 12]. В работе [13] показано, что 5-[(4-азидофенацил)тио]-СТР в составе 7-членно-го РНК-продукта транскрипционной реакции ко-валентно модифицирует Т7РНКП. Однако дальнейшего развития эта работа не получила, и мишень модификации не была установлена.
В нашей предыдущей работе [14] мы показали, что аналогичное производное UTP с несколько отличающейся структурой и длиной спейсера 5 -[3-(Е)-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамидо)про-пенил-1]-иТР (N3-TFBP-UTP) также является субстратом полимеразной реакции, катализируемой Т7РНКП. Хотя общая эффективность включения данного соединения в растущую РНК-цепь не превышает 10%, основные затруднения при этом связаны с формированием фосфодиэфирной связи после модифицированного остатка; включение же такового в З'-конец цепи РНК осуществляется с эффективностью, близкой к 100%. Эти предварительные результаты позволили нам рассматривать данное соединение как достаточно удобное для регистрации ковалентного взаимодействия между З'-концом РНК-продукта и близкорасположенными аминокислотными остатками в структуре Т7РНКП, которые могут участвовать в каталитическом акте.
В данной работе мы представляем результаты применения 5-[3-(Е)-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбен-замидо)пропенил-1]-иТР (N3-TFBP-UTP, рис. 1) в качестве аффинного модификатора ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
В работе использовали трипсин ("Boehringer", Германия), рибонуклеазу Т1 ("Sigma", США), рибо-нуклеозидтрифосфаты ("Promega", США), трис-ги-дроксиметиламинометан (Трис) ("Ficher", США), ß-меркаптоэтанол ("Merck", Германия) и реактивы фирмы "Реахим" (Россия) квалификации ос.ч.
Ферментный препарат и определение активности. Выделение и очистку Т7РНКП проводили по ранее описанной методике [15]. Активность фермента определяли в соответствии с работой [1]. В качестве матриц использовали плазмиды, содержащие Т7-промотор: pTZ18R (Pharmacia) и pTZR7G [16]. Регистрацию коротких РНК-продуктов, образующихся при отсутствии одного из нуклеотидных субстратов в реакционной смеси, осуществляли авторадиографией после разделения в 20%-ном ПААГ по стандартной методике
O O
O
HO-P-O-P-O-P-O OH OH OH
O
bV
NH
O-V
O F
II
X
F F
"CH 2 NH ^ V-N3
F F
OH OH
Рис. 1. Структурная формула ^-ТРВР-иТР-фотоаффинного модификатора Т7РНКП.
[17]. Для определения ковалентного связывания реакционные пробы подвергали УФ-облучению (X = 330 нм) в течение различных промежутков времени (5-30 мин) и проводили белковый электрофорез в 12%-ном ПААГ по Лэммли [18].
Препаративное выделение Т7РНКП, модифицированной продуктом реакции, содержащим ^-ТГБР-иМР. 0.2 мг Т7РНКП в 0.2-0.5 мл стандартного буфера для определения активности Т7РНКП (50 мМ Трис-НС1, рН 7.9, 10 мМ М§С12,
5 мМ Р-меркаптоэтанол) инкубировали в кварцевой кювете в присутствии 0.5 мг плазмиды рТ2Я70, по 0.5 мМ ЮТР, гАТР, К3-ТРБР-ШР и 0.1 мКи [а-32Р]АТР 15 мин при 30°С в темноте, а затем 30 мин при УФ-облучении (X = 330
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.