ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 417, № 5, с. 710-713
^ ОБЩАЯ
БИОЛОГИЯ
УДК 576.341:591391
ФОТОБИОМОДУЛЯЦИЯ ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫМ ИЗЛУЧЕНИЕМ
_ __V
1тах = 626 нм РАЗВИТИЯ РАННИХ ЭМБРИОНОВ МЫШЕИ
© 2007 г. Т. А. Свиридова-Чайлахян, С. И. Паскевич, Л. И. Фахранурова, Р. Н. Храмов, А. А. Манохин, Н. Б. Симонова, член-корреспондент РАН Л. М. Чайлахян
Поступило 16.08.2007 г.
Раннему эмбриогенезу млекопитающих посвящено огромное количество работ, однако по-прежнему актуальны исследования, связанные с условиями поддержания жизнеспособности зародышей in vitro. Существующие здесь проблемы значительно возрастают после различных манипуляций, например, в работах по искусственному оплодотворению, при пересадках ядер соматических клеток, а также при получении линий эмбриональных стволовых клеток на основе таких зародышей [1-3]. Среди факторов, влияющих на полное предымплантационное развитие эмбрионов в культуре, наименее изученным является действие видимого света. Восприимчивость биологических объектов к излучению всего оптического диапазона общеизвестна, но при этом работы, посвященные влиянию света различных длин волн и различной интенсивности на эмбрионы млекопитающих, крайне малочисленны. В этих работах показано, что видимый свет (стандартное лабораторное освещение и освещение стерео-микроскопа) оказывает на развитие зародышей неблагоприятное воздействие [4-8], например, инициирует увеличение ДНК-повреждений в одноклеточных зародышах хомячка в сравнении с такими же клетками in vivo [4], уменьшает степень развития эмбрионов до морул и бластоцист у хомячков и кроликов [7, 8]. Наиболее повреждающее воздействие видимый свет оказывает в синей части спектра (445-500 нм), приводя, в частности, к синтезу специфических стрессовых белков теплового шока, а также к увеличению количества апоптозных бластомеров в эмбрионах на стадии бластоцисты [5, 7]. Вместе с тем ви-
Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской Академии наук, Пущино Московской обл. Институт биофизики клетки Российской Академии наук, Пущино Московской обл.
Нижегородский Государственный Университет им. НИ. Лобачевского
димый свет в красной части спектра (620-750 нм) оказывает положительное действие на развитие зародышей in vitro [7].
Фотобиомодулирующий эффект излучения оранжево-красного диапазона спектра к настоящему времени достаточно убедительно продемонстрирован на различных клетках млекопитающих и на уровне целых организмов при использовании лазера [9-10], а также при использовании светодиодной матрицы с максимумом в оранжево-красной области с ^^ = 625 нм [11]. При этом феномен фотобиомодуляции затрагивает разнообразные биологические процессы, включая клеточную пролиферацию, синтез ростовых факторов, увеличение клеточной подвижности, восстановительные процессы и многие другие. В последнее время активно проводятся работы по фотобиомодуляции с применением особых светопреобразую-щих субмикронных фотолюминофоров, трансформирующих излучение определенной длины волны в излучение с другой длиной волны.
Значительный интерес вызывает выяснение характера влияния видимого света на ранние эмбрионы млекопитающих с использованием фотолюминофоров, которые трансформируют ультрафиолетовое (УФ) излучение, негативное для клеток [12, 13], в оранжево-красную часть спектра, обладающего биостимулирующим действием [14]. Как свидетельствует вся экспериментальная практика, наилучшей моделью для получения новых знаний и практических подходов на млекопитающих являются ранние эмбрионы мышей [1, 15]. В настоящей работе исследовали влияние на развитие зародышей мышей в условиях in vitro искусственного солнечного излучения, моделируемого ксеноновой лампой, и преобразованного искусственного солнечного света с дополнительной оранжево-красной люминесцентной компонентой.
В качестве источника искусственного солнечного света был применен осветитель ЛОС-1 с ксеноновой лампой высокого давления мощностью 150 В. Измерение интенсивности излучения проводили пиранометром "СМР3" ("Kipp & Zonen", Нидерланды). Интенсивность светового потока от ксеноновой лампы (400-1800 нм), прошедшего че-
9
Рис. 1. Динамика развития эмбрионов в трех группах в течение 96 ч культивирования in vitro. 1-4 эмбрионы, контроль; 5-8 после действия "солнечным" светом; 9-12 после действия преобразованным "солнечным" светом с люминесцентной компонентой.
5
рез люминесцентный экран, составляла 160 Вт/м2. Освещенность света, падающего на планшеты с эмбрионами, измеряли с помощью Люксметра-Ю116 с фотоэлементом Ф55С. В работе использовали специальный светопреобразующий экран на основе поликарбонатного пластика, непрозрачного в УФ диапазоне и прозрачного в видимом диапазоне света. Нанесенный на экран слой микродисперсного (с размерами частиц 100-500 нм) фотолюминофора оксисульфида иттрия, активированного европием, Yj.9Eu0.AS (ООО НПФ "Свет", г. Ставрополь), давал дополнительную люминесцентную компоненту с максимумом на 626 нм, эмиссия которой наблюдалась при поглощении УФ-ком-поненты.
Облучение зародышей проводили двумя различными способами: 1) искусственным солнечным светом (поликарбонатная сторона экрана обращена к источнику ксенонового света); 2) искусственным солнечным светом, пропущенным через светопреобразующий экран (люминофор-ная сторона экрана обращена к источнику ксенонового света). В зависимости от положения экрана (1) или (2) по отношению к облучаемому объекту спектр падающего излучения на зародыши был без люминесцентной компоненты (1) или с люминесцентной компонентой (2). Интенсивность люминесцентной компоненты в диапазоне 603-637 нм составляла 0.5 Вт/м2, время световой экспозиции 15 мин, что соответствует дополнительной дозе облучения 0.045 Дж/см2.
Работа была выполнена на мышах F1 (CBAxC57BL/6). Мышей получали из питомника "Столбовая". При этом возраст самок составлял 1.5-2 мес, возраст самцов 3 мес. Суперовуляцию самок проводили по стандартной методике инъекцией гормона Folligon ("Intervet International B.V.", Нидерланды) в дозе 10 IU в 16.00 и через 44 ч инъецировали гормон HCG ("Sigma") в дозе 10 IU. Эмбрионы на стадии зиготы получали спустя 27 ч после инъекции HCG. Манипуляции по вымыванию зародышей из каждого отдельного яйцевода и последующему сбору эмбрионов проводили под стереомикроскопом в пределах 1.53 мин. Группы из 10-15 зародышей помещали в отдельные пластиковые 4-луночные планшеты "Nunclon" ("Nunc™" Gibco Europe Ltd). Для манипуляций с эмбрионами использовали среду М2 ("Sigma"). Культивирование эмбрионов in vitro после действия различным светом проводили в среде М 16 ("Sigma") в инкубаторе С02 "Binder". За развитием зародышей наблюдали с 12-24-часовым интервалом в течение 4 сут. В качестве контроля использовали интактные зиготы.
Были проведены следующие опыты с эмбрионами мышей: облучение зигот искусственным солнечным светом (без люминесцентной составляющей) в течение 15 мин и облучение зигот преобразованным "солнечным" светом с оранжево-красной люминесцентной компонентой также в течение 15 мин. Всего было использовано 204 зародыша. Примеры эмбрионов на стадии зиготы непосредственно перед использованием в опытах и в контроле показаны на рис. 1, 1, 5, 9. Наблюде-
712 СВИРИДОВА-ЧАЙЛАХЯН и др.
Таблица 1. Результаты культивирования in vitro облученных и контрольных зигот мышей
Условие облучения Число зигот в опыте 48 ч культивирования in vitro 72 ч культивирования in vitro 82-96 ч культивирования in vitro
неадгезир. 8-16 кл морулы, % морулы, % бластоци-сты, % бластоци-сты, % из них % выхода из оболочки
"Солнечный" свет "Солнечный" свет с люм. комп. Контроль 53 78 73 35.8% (19/53) 20.5% (16/78) 15.1% (11/73) 50.9% (27/53) 75.6% (59/78) 52.1% (38/73) 49.0% (26/53) 34.6% (27/78) 50.7% (37/73) 39.6% (21/53) 61.5% (48/78) 36.9% (27/73) 75.5% (40/53) 96.2% (75/78) 67.1% (49/73) 45.3% (24/53) 80.8% (63/78) 28.8% (21/73)
ние за последующим развитием зародышей in vitro позволило выявить следующие характерные различия между данными группами. В то время как в контроле через 48 ч культивирования наблюдали в основном 8-клеточные морулы, среди зародышей после действия "солнечным" светом 10-12-клеточные морулы; в группе зародышей после действия преобразованным "солнечным" светом с дополнительной оранжево-красной люминесцентной компонентой наблюдали 16-клеточные морулы (рис. 1, 2, 6,10). Спустя 72 ч культивирования в контроле были в основном морулы с кавитацией и ранние бластоцисты. Среди зародышей, облученных преобразованным "солнечным" светом с люминесцентной компонентой, были преимущественно зрелые бластоцисты (рис. 1, 3, 7, 9) и спустя 82-96 ч культивирования in vitro у большинства из них отмечали выходы из блестящей оболочки (различия в степени выходов по группам рис. 1, 4, 8,12). Группа эмбрионов, облученных искусственным солнечным светом без люминесцентной составляющей, уступала в количественном от-
%
120 100 80 60 40 20
0
Контроль
Солн.
Люм.
Рис. 2. Количество эмбрионов, развивающихся до стадии бластоцисты во всех группах. * - достоверная разница между контролем и группой (Люм.), облученной преобразованным "солнечным" светом с люминесцентной компонентой (Р < 0.05). ** - достоверная разница между группой (Солн.), облученной "солнечным" светом и группой (Люм.), облученной преобразованным "солнечным" светом с люминесцентной компонентой (Р < 0.05).
ношении зародышам, облученным преобразованным "солнечным" светом с люминесцентной компонентой. Данные по развитию эмбрионов всех групп в культуре in vitro представлены в табл. 1.
Суммированные данные свидетельствуют, что облучение одноклеточных зародышей (на стадии зиготы) преобразованным "солнечным" светом с дополнительной оранжево-красной люминесцентной компонентой в течение 15 мин оказывает положительный эффект на последующее пред-ымплантационное развитие in vitro. Наблюдаем существенное повышение процента эмбрионов, развивающихся до стадии бластоцисты в течение 72 ч культивирования in vitro (61.5%) по сравнению с контролем (36.9%) и до стадии бластоцисты (96.2%) с выходом из блестящей оболочки (80.8%) в течение 82-96 ч культивиров
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.