научная статья по теме ФОТОФИЗИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ ПРЕОБРАЗОВАНИЯ ЭНЕРГИИ В МЕМБРАНАХ ТИЛАКОИДОВ У МУТАНТОВ CHLAMYDOMONAS REINHARDTII D1-R323Н, D1-R323D И D1-R323L Биология

Текст научной статьи на тему «ФОТОФИЗИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ ПРЕОБРАЗОВАНИЯ ЭНЕРГИИ В МЕМБРАНАХ ТИЛАКОИДОВ У МУТАНТОВ CHLAMYDOMONAS REINHARDTII D1-R323Н, D1-R323D И D1-R323L»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2010, том 27, № 3, с. 283-292

УДК 577.3

ФОТОФИЗИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ ПРЕОБРАЗОВАНИЯ ЭНЕРГИИ В МЕМБРАНАХ ТИЛАКОИДОВ У МУТАНТОВ Chlamydomonas reinhardtii D1-R323Н, D1-R323D и D1-R323L © 2010 г. Г. П. Кукарских, В. Э. Загидуллин, Т. К. Антал, Т. Е. Кренделева, В. З. Пащенко

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991 Москва; факс (495)939-1115; электронная почта: gkukarsk@mail.ru Поступила в редакцию 27.07.2009 г.

У мутантов Chlamydomonas гвткаМШ В1-Я323Н, В1-Я323В и В1-Я323Ь обнаружено увеличение выходов флуоресценции по мере нарастания нарушений кислородвыделяющей активности. Кинетики затухания флуоресценции зарегистрированы методом однофотонного счета в пико- наносе-кундном временном диапазоне. Полученные кинетические кривые аппроксимировали суммой трех экспонент. Установлено, что у контрольного псевдодикого типа (р'М) вклад в общую интенсивность флуоресценции первого (быстрого) компонента, отражающего время миграции энергии от антенного комплекса к реакционным центрам (РЦ) фотосистемы II (ФС II), превышает 50%. У мутантов по мере снижения кислородвыделяющей активности доля первого компонента уменьшается и возрастает вклад второго, более медленного компонента, который связывают с переносом электрона от Р680* к QА. У мутанта, совсем не способного выделять кислород, в кинетике затухания флуоресценции практически нет быстрого компонента, а кинетика затухания флуоресценции описывается двумя примерно равными по амплитуде долгоживущими компонентами с временами около 2 и 3 нс. Предполагается, что они обусловлены рекомбинацией зарядов в первичной ион-радикальной паре [Р680+* Ф-* ] и свечением светособирающих комплексов, энергетически разобщенных с РЦ ФС II. В кинетиках индукции флуоресценции, зарегистрированных методом РЕА, у мутантов со сниженной активностью выделения кислорода появляются К-пики. Полученные результаты позволяют предположить, что вызванные мутацией нарушения во взаимодействии кислородвыделяющего комплекса (КВК) с донорной стороной РЦ приводят к повышению среднеточечного редокс-потен-циала QА на акцепторной стороне.

Ключевые слова: : Chlamydomonas reinhardtii, мутанты Б1-Я323, флуоресценция хлорофилла, фотосистема II.

Фотосистема (ФС) II фотосинтетических ти-лакоидных мембран выполняет сложную функцию Н2О/пластохинон-оксидоредуктазы с использованием энергии света [1]. При этом одно-электронные фотохимические процессы сопрягаются с четырехэлектронным механизмом переноса электрона на донорной стороне и двух-электронными реакциями на акцепторной. Первичный электронный донор Р680 захватывает возбуждение из светособирающей антенны, а затем из возбужденного состояния Р680* отдает электрон на промежуточный электронный акцептор феофитин (Ф). Далее электрон с восстановленного Ф-' переносится на первичный акцептор QА, представляющий собой связанную с белком молекулу пластохинона. QА является одноэлек-тронным переносчиком, поэтому в полувосстановленном состоянии он передает свой электрон следующему пластохинону, QB. В отличие от QА, QB действует как двухэлектронный акцептор, он стабилен в полувосстановленном прочно связанном с белком состоянии. Полностью восстанов-

ленный дважды протонированный QBН2 легко диффундирует с места посадки, а его место занимает окисленная молекула пластохинона из свободного пула, обеспечивая следующий двухэлек-тронный реакционный цикл. Фотоокисленный Р680+' восстанавливается электронами, источником которых служит вода, через вторичный донор электронов тирозин (У2). Расщепление молекулы воды — высокозатратная энергетическая реакция, которая осуществляется с участием кислородвы-деляющего комплекса (КВК). Этот комплекс может накапливать последовательно четыре окислительных эквивалента, требующихся для освобождения четырех электронов и протонов, а также одной молекулы кислорода из двух молекул воды. В состав КВК входят четыре иона Мп, один ион Са и, возможно, один ион хлора. Во время каталитического цикла ионы Мп в КВК существуют в разной степени окисленности. Эти состояния обозначаются как 8-состояния с цифровым индексом от 0 до 4, указывающим количество накопленных окислительных эквивалентов [1, 2].

Есть данные, что состояние донорной стороны ФС II оказывает существенное влияние на свойства акцепторной. Так, в отсутствие функционально активного КВК при выращивании клеток Scenedesmus оЪЩыш в полной темноте, а также при удалении Мп из КВК гидроксиламином в препаратах ФС II из шпината окислительно-восстановительный потенциал РА сдвигается в положительную сторону. После инкубации препаратов на свету в присутствии МпС12 и СаС12 возобновляется выделение кислорода, и средне-точечный потенциал РА изменяется в обратную сторону — от +55 к —80 мВ [3, 4]. Предполагается, что изменение потенциала рА может иметь физиологический смысл, так как обеспечивает защиту реакционных центров от фотодеструкции активными формами кислорода [5, 6]. Рекомбинация зарядов в радикальной паре [Р680+* РА* ] может идти двумя путями: непрямым — с образованием промежуточного состояния [Р680+* Ф-*],

и прямым туннелированием электрона от РА* к

дырке на Р680+* с образованием исходного состояния. Соотношение между этими путями определяется разностью в свободной энергии между радикальными парами [Р680+* РА* ] и [Р680+* Ф-*].

Если энергетический зазор между Ф *и РА* небольшой, то обратная реакция идет с большим выходом через первый (непрямой) путь с последующим образованием триплетов и далее син-глетного кислорода. При повышении потенциала РА вероятность повторного образования состояния [Р680+* Ф-*] за счет обратной реакции переноса электрона понижается, а возрастает вероятность прямой рекомбинации РА* с фотоокислен-

ными Р680+* или У^*. В условиях недостаточного донирования электронов от КВК время жизни этих сильных окислителей значительно возрастает, что увеличивает риск повреждающего действия, хотя, с другой стороны, повышается вероятность рекомбинации с РА*.

Эффективность ФС II по превращению энергии света в энергию разделенных зарядов довольно высока, но, тем не менее, на всех этапах этого сложного процесса возможны потери, которые могут быть тепловыми или сопровождаться высвечиванием квантов света (флуоресценция). Изучение кинетических параметров флуоресценции позволяет судить об эффективности отдельных этапов функционирования РЦ ФС II у объектов с измененным структурно-функциональным состоянием. Как уже отмечалось выше, изменения в функционировании донорной стороны ФС II могут быть вызваны химическими агентами, такими как гидроксиламин [4], выращиванием

объекта в полной темноте [4], а также прогреванием образца при температурах 44-48°С [7, 8]. В этой работе нами были использованы мутанты Chlamydomonas геткаМШ Э1-Я323Н, В1-Я323Э и 01^323^ различающиеся по скорости фотосинтетического выделения кислорода. Поскольку аргинин 323 локализован на люменальном участке Е-субъединицы Э1-белка, принимающем участие в обеспечении взаимодействия марганцевого кластера КВК с РЦ [1, 9], его замена на другие аминокислотные остатки может влиять на эффективность донирования электронов от воды. В результате, при замене положительно заряженного аргинина Я323 на положительно же заряженный (или нейтральный в зависимости от локального окружения) гистидин (Я323Н) фотосинтетическое выделение кислорода снижается не очень значительно, в то время как при замене аргинина Я323 на отрицательно заряженный аспар-тат (Я323Э) скорость выделения кислорода уменьшается примерно вдвое. При замене аргинина на нейтральный гидрофобный лейцин (Я323Ь), видимо, полностью нарушается взаимодействие КВК с РЦ, и кислород не выделяется [10, 11]. У этих мутантов, характеризующихся разной скоростью выделения кислорода, а следовательно, и разной эффективностью донирования электронов от КВК на РЦ, исследовали индукционные кривые флуоресценции хлорофилла, а также кинетики затухания флуоресценции в пи-ко-наносекундном временном диапазоне.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Получение и культивирование псевдодикого типа и мутантов Chlamydomonas reinhardtii. Объектом исследования служили псевдодикий тип (р1^) и мутанты Э1-Я323Н, В1-Я323Э и Э1-Я323Ь, предоставленные кафедрой биологии растений университета штата Огайо (США). Мутанты и р11 были получены путем сайт-направленного мутагенеза [12]. Для замены аргинина (Я) на другую аминокислоту, гистидин (Н), аспартат (Э) или лейцин (Ь), модифицированный ген psЪА, кодирующий белок Э1, был встроен в psЪА-де-фицитный геном мутанта СС-741; р1 получен путем встраивания в геном мутанта СС-741 не-модифицированного генаpsЪA. Все мутации подтверждены секвенированием ДНК трансгенных водорослей. Клетки р1 С. геткаМШ выращивали фотогетеротрофно на трис-ацетат-фосфатной среде, рН 7.0, в конических колбах объемом 300 мл на качалке при 25°С и освещенности 100 мкЕ м-2 с-1. При культивировании клеток мутантов освещенность была понижена до 50 мкЕ м-2 с-1.

Метод счета фотонов. Кинетики затухания флуоресценции регистрировали методом счета фотонов с помощью ультраскоростной системы

Simple-Tau 140 ("Becker & Hickl", Германия). Флуоресценцию в образцах возбуждали излучением диодного лазера BHLP—700, рабочая частота которого была 50 МГц. Средняя мощность лазерного излучения составляла 5 мВт (энергия отдельного импульса ~1 нДж), длительность импульса света на полуширине составляла <100 пс, длина волны возбуждения — 635 нм. Энергию лазерного импульса ослабляли с помощью светофильтра НС—11 (примерно в 20000 раз) и подавали на образец. Флуоресценцию регистрировали высокоскоростным детектором PMC-100 (Hamamatsu H5773, Япония) под углом 90° к возбуждающему свету. Сигнал флуоресценции отделяли от возбуждающего света с помощью светофильтра КС—18, который одновременно ослабляет сигнал флуоресценции в диапазоне 670— 720 нм примерно в 10 раз. С учетом квантового выхода флуоресценции объекта и геометрии све-тосбора в описанной конфигурации регистрировался один квант флуоресценции на ~10 квантов возбуждающего света. Сигнал с детектора обрабатывался модулем SPC—140 ("Becker & Hickl", Германия), которы

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком