ФОТОБИОЛОГИЯ
УДК 535.372:544.522.1
ФОТОФИЗИКА И ФОТОХИМИЯ КРИСТАЛЛИЧЕСКОГО
5-ФТОРУРАЦИЛА
© 2014 г. С. С. Остахов*, М. В. Султанбаев*, С. Л. Хурсан*, Н. М. Шишлов*, Ю. А. Лебедев**, Р. Р. Кинзябулатов**
*Институт органической химии Уфимского научного центра РАН 450054, Уфа, просп. Октября, 71 Е-таИ: chemlum@anrb.ru **Институт физики молекул и кристаллов Уфимского научного центра РАН 450075, Уфа, просп. Октября, 151 Поступила в редакцию 19.03.2014 г. В окончательном виде 28.03.2014 г.
Исследована флуоресценция и фотохимические процессы в кристаллическом 5-фторурациле (БИ). Методами спектрально-люминесцентной спектроскопии и ЭПР установлено, что при фотооблучении БИ осуществляется фотоиндуцированный перенос электрона и протона, приводящие к образованию трех гидроксо-таутомеров и ион-радикальных пар, которые стабилизируются кристаллической матрицей и люминесцируют при длинах волн эмиссии 375, 415, 455 нм и 530, 555 нм соответственно.
БО1: 10.7868/80023119714050111
Один из главных в фотобиологии вопрос о первичных механизмах действия излучений на основные биохимические компоненты живых клеток не теряет своей актуальности. Важнейшим представителем синтетических аналогов урацила и тимина — структурных элементов ДНК и РНК — является противоопухолевый препарат 5-фтор-урацил (БИ). В то же время ощущается дефицит сведений о фотофизических (излучательный и безызлучательный перенос энергии) и фотохимических (фотоиндуцированный перенос протона (ФПП) и фотоиндуцированный перенос электрона (ФПЭ)) процессах, протекающих в электронно-возбужденных состояниях БИ в растворах и твердом состоянии.
Известно, что присутствие редких таутомер-ных форм нуклеиновых оснований может влиять на репликацию ДНК, приводя к точечным мутациям [1]. 5-Фторурацил обладает флуоресценцией (ФЛ) и в [2, 3] мы впервые экспериментально зарегистрировали индивидуальные спектры ФЛ 4-х из 6-ти возможных (рис. 1) таутомеров А, В, Э и С БИ в нейтральных водных растворах.
Было принято считать, что в Н-связанной кристаллической решетке дегидратированный 5-фтор-урацил существует только в диоксо-форме А [4]. Однако нами обнаружено [5], что при фотооблучении поликристаллического БИ в результате межмолекулярного ФПП наблюдается образование его енольных таутомеров, которые регистрируются по спектрам ФЛ и стабилизируются кристаллической матрицей.
При радиолизе рентгеновскими лучами монокристаллов БИ [6], его водных сернокислых и фосфорнокислых стекол [7], а также сокристал-лов с 1-метилцитозином [8, 9] методом ЭПР обнаружен ФПЭ, сопровождающийся последующим переносом протона и приводящий к образованию Я1 и Я2 радикалов 5-фторурацила (рис. 2).
В фотооблученных поликристаллических образцах БИ зарегистрирована ФЛ при длинах волн эмиссии (^ет) 530 и 555 нм [5], отнесенная нами к люминесценции ион-радикальных пар. Однако эта гипотеза требовала экспериментального обоснования.
0
О^м- -Н
1
Н
A
ОН
Лр
О^^Н
I
Н D
О
О
Н
Б
N
А
НО N Н B
ОН
N
Л
НО N Н E
Б
НО N Н
I
Н
C
ОН
О N Н
Рис. 1. Таутомеры 5-фторурацила.
O
H J\/F
N у
O^NA H
R1
H \
0
H Д^/F N Y
O^N ^ H
1
H R2
Рис. 2. Радикалы 5-фторурацила.
Целью настоящей работы было исследование методами спектрально-люминесцентной спектроскопии и ЭПР процессов ФПП и ФПЭ, приводящих к образованию енольных таутомеров и радикальных пар в поликристаллическом 5-фтор-урациле.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре "8рееогё М-40", скорректированные спектры ФЛ и возбуждения ФЛ — на спектро-флуориметре "СМ-2203". 5-Фторурацил фирмы
"Aldrich" (99.5%) использовали без предварительной очистки. Тонкие слои кристаллических образцов FU готовили упариванием его водных растворов на боковой поверхности кварцевой кюветы (1=2 мм) и облучали светом ксеноновой лампы на длине волны возбуждающего света (^ex) 265 нм непосредственно в кюветном отделении спектрофлуориметра. Интенсивность светового потока определяли c помощью радиационного компенсированного термоэлемента РТН-1У. Ре-комбинационную люминесценцию регистрировали на фотометре с чувствительностью 103 квант/с. Спектры ЭПР регистрировали на спектрометре 3-сантиметрового диапазона "Bruker EMX" (Bruker Biospin GmbH, Германия). В качестве эталонов интенсивности и g-фактора применялись 1,1'-дифенил-2-пикрилгидразил (ДФПГ) (g = = 2.0036) и Bruker Strong Pitch (g = 2.0028). Точность определения величины g-фактора была не хуже ±0.0002.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
По данным рентгеноструктурного анализа установлены 2 кристаллические формы FU: (а) [10] и (б) [11], представленные на рис. 3. Теоретически обосновано существование кристаллической структуры FU (в) (рис. 3) [12]. Обнаружено, что при фотооблучении кристаллических образцов FU в длинноволновом максимуме поглощения -«— ¿0-перехода (^ex = 265 нм) наблюдается изменение спектрального состава флуоресценции (рис. 4а). В необлученных кристал-
(a)
H H
У-N O
F^ )=O--H4 Л
F
У-N
O H H ,O
N4
O и F
H H
NN
-H'
-Q
H
V.N. .К
O--H у H
F O
O
H X /H
N N
F
-a
O
V'H
// N
F-Ty-O
У-N
O H
H
H у O
F
-H
HO
N-4 / \
Y
H H
O
(б) O
H у "O
F
, „ ,.H ^r" ^v H
N N
O I HO
(в)
H у O
F
O
F O F
ж^^н^н h'^^h
O O F F O' .O
N N H^J^^O- N N
H
F
^ H T O
H Y н F
O
F
Рис. 3. Кристаллические формы 5-фторурацила: а [10]; б [11]; в [12].
I, отн. ед. -| 0.8
- 0.6
Н 0.4
\
\
I, отн. ед.
10 8 6 4 2 0
2 1
0
(а)
АЛ
0.06
0.04
0.02
0
250 300 350 400 450 500 1, нм
Рис
0
X, нм
Рис. 4. (а) Спектры ФЛ кристаллического БИ: 1 — не-облученный; 2 — 2 мин облучения; 3 — 20 мин облучения (Хех = 265 нм, 1.5 х 1014 квант/(см2 с), 300 К). (б) Результаты покомпонентного разложения спектра 3 (а). (в) Спектры ФЛ таутомеров БИ в ЩО: 1 — А (Хех = 265 нм); 2 - В (Хех = 305 нм); 3 - Б (Хех = = 320 нм); 4 - С (Хех = 340 нм). (с (БИ) = 10-4 моль/л, рН 7, Т = 300 К).
лических образцах БИ регистрируется одна полоса ФЛ с максимумом Хет = 334 нм (рис. 4а, спектр 1), соответствующая излучению дике-то-формы 5-фторурацила. В процессе фотолиза наблюдается уменьшение интенсивности ФЛ ди-оксо-таутомера А и появление новых полос излучения в коротковолновой "синей" (Хет = 375, 415, 455 нм) и длинноволновой "зеленой" (Хет = 530, 555 нм) областях спектра (рис. 4а, спектры 2, 3).
Результаты интерпретированы нами с позиций ФПП, приводящего к образованию гидрок-со-форм 5-фторурацила и ФПЭ с генерацией радикалов.
Поиски переноса протона под действием света между молекулами, образующими водородную связь, были начаты А.Н. Терениным в 1944 г. Впервые явление ФПП, наблюдаемое в спектрах ФЛ, обнаружено в акридиновых производных при низких температурах [13]. Процесс протекает между молекулами, образующими сильную водородную связь в условиях, когда "лабильный" про-
. 5. 1 — Разностный спектр поглощения, полученный вычитанием спектра необлученного кристаллического FU из спектра фотолизованного FU (АЛ — изменение оптической плотности FU при УФ-облуче-нии). 2 — Спектр возбуждения ФЛ фотооблученного кристаллического FU (время фотолиза 120 мин, Xex = = 265 нм, 1.5 х 1014 квант/(см2 с), Xem = 600 нм, 300 К).
тон находится в поле обеих компонент и может реализоваться в кристаллическом 5-фторурациле (рис. 3).
Доказательством наличия ФПП в кристаллическом FU может служить образование енольных таутомеров B, D и C, спектрально-люминесцентные параметры которых в водных растворах определены в [2, 3]. На рис. 4б приведены результаты покомпонентного разложения спектра 3 (рис. 4а) с помощью программы анализа нелинейных графиков (Origin 8). Как видно из сравнения спектров на рис. 4б и 4в, максимумы ФЛ после фотолиза кристаллического FU в "синей" области Xem = 375, 415, 455 нм удовлетворительно коррелируют с таковыми для минорных таутомеров B, D и С в нейтральных водных растворах: Xem = 378, 414, 434 нм.
Из разностного спектра поглощения 1 на рис. 5, полученного вычитанием спектра необлученного кристаллического 5-фторурацила из его спектра после фотолиза, видно, что УФ-облучение приводит к образованию, как мы полагаем вследствие ФПП, фотопродуктов, поглощающих в видимой области в двух спектральных диапазонах 310-420 нм и 450-550 нм (рис. 5, спектр 1). Это предположение подтверждается тем, что ранее при облучении кристаллического 2-(2',4'-динит-робензил)-пиридина наблюдали ФПП, также приводящий к образованию долгоживущих окрашенных таутомеров, которые регистрируются в спектрах поглощения [14].
Изменения при фотолизе претерпевает и спектр возбуждения ФЛ FU (рис. 5, спектр 2), с учетом спектрального сдвига коррелирующий со спектром ФЛ фотооблученного кристаллическо-
го 5-фторурацила (рис. 4а, спектр 3). Максимум при 275 нм в спектре возбуждения ФЛ соответствует поглощению дикето-формы А 5-фторура-цила. В интервале длин волн 310—420 нм максимумы в спектре возбуждения ФЛ фотолизованного Би при 345, 380 нм (рис. 5, спектр 2) удовлетворительно коррелируют с таковыми в УФ-спектре при 352, 372 нм (рис. 5, спектр 1) и обусловлены, по нашему мнению, образованием гидроксо-форм 5-фторурацила.
В [15] впервые был обнаружен двойной перенос протона в возбужденном состоянии димера 7-аза-индола (7-А1) — модельной структуры, аналогичной Н-связанным парам оснований ДНК аденин-тимин и гуанин-цитозин, с двумя водородными связями, приводящий к фотоиндуцированному образованию таутомерных форм (реакция (1)):
Исходный димер
Таутомер
кV
(1)
Кристаллические структуры Би (рис. 3) имеют димерные фрагменты, в которых между молекулами существуют 2 водородные связи, и ФПП в димерах может приводить к образованию енольных форм В, Э и С 5-фторурацила по реакциям (2), (3) и (4) соответственно.
и-
О Б
М
о и
и
и
и
О
к
и—А ^и
О Б
>"Ч
О и
и I
\ О
и
(2)
Б
О
и и
Б—(А ^О
О и
и—£ В м-и Б О
и и
и
О
к
О
и
и
и и
и
I
О
(3)
N=1
N и и
и
О=^ А и
N4
и
О
Ь''
и
к
О=\ с и
■ О
и 1
О и
-к
и-м а ) о
и
Б
N
с О и Б
В отличие от растворов, где в условиях кето-енольного равновесия гидроксо-формы Би присутствуют в минорных количествах, в твердом состоянии они стабилизируются кристаллической матрицей и накапл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.