БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2014, том 40, № 5, с. 636-638
^ ПИСЬМА
РЕДАКТОРУ
УДК 547.963.3
ФОТОГЕНЕРАТОР ТРИХЛОРУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ -ПЕРСПЕКТИВНЫЙ ДЕТРИТИЛИРУЮЩИЙ АГЕНТ ДЛЯ МИКРОЧИПОВОГО ОЛИГОНУКЛЕОТИДНОГО СИНТЕЗА
© 2014 г. А. Н. Синяков*, #, Е. Б. Николаенкова**, И. А. Оськина**, В. А. Савельев**, В. А. Самсонов**, А. Я. Тихонов**, М. Ю. Палаткина***, Д. Е. Зайцев***
*Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск **Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН, Новосибирск ***Новосибирский государственный университет, Новосибирск
Поступила в редакцию 05.03.2014 г. Принята к печати 22.04.014 г.
В рамках поиска эффективных фотоактивируемых детритилирующих агентов для микрочипового синтеза олигодезоксирибонуклеотидов исследован [4-(4-метоксифенил)-2,6-динитрофенил](фе-нил)метил-2,2,2-трихлорацетат, генерирующий трихлоруксусную кислоту при облучении светом с длиной волны 405 нм. Показана применимость этого агента для снятия 4,4'-диметокситритильной защитной группы в процессе твердофазного синтеза ряда дезоксиолигонуклеотидов.
Ключевые слова: фотогенераторы кислот, тритильный катион, олигодезоксирибонуклеотиды, синтез.
БО1: 10.7868/80132342314050121
Развитие олигонуклеотидного синтеза на микрочипах позволило создать широкий спектр диагностических тестов, основанных на методах нуклеиновой гибридизации и минисеквенирования нуклеиновых кислот, а также получать смесь целевых олигонуклеотидов, необходимых для конструирования разнообразных генетических элементов для нужд синтетической биологии [1, 2].
Перспективной схемой микрочипового синтеза олигонуклеотидов является подход, использующий фотоактивированное детритилирование [3], при этом все остальные стадии наращивания олигонуклеотидной цепи являются традиционными и хорошо отработанными. При фотохимическом детритилировании, как правило, используются фоточувствительные соединения, генерирующие сильные минеральные кислоты, потенциально способные вызывать апуриниза-цию олигонуклеотидов [4]. Вместе с тем для деблокирования 4,4'-диметокси-тритильной группы в тонких пленках недавно было предложено использовать замещенные 2-нитробензилтри-хлорацетаты [5]. При фотолизе этих соединений выделяется широко использующаяся в твердо -фазном олигонуклеотидном синтезе трихлорук-сусная кислота. Установлено, что 2-нитробензи-лтрихлорацетаты [5] могут быть использованы
# Автор для связи (тел.: +7 (383) 363-51-73, факс: +7 (383) 36351-53; эл.почта: sinyakov@niboch.nsc.ru).
для детритилирования в тонких полимерных пленках при облучении ультрафиолетом с длиной волны 365 нм. Среди 2-нитробензилтри-хлорацетов [5] только один, а именно, [[4-(4-ме-токсифенил)-2,6-динитрофенил](фенил)метил]-2,2,2-трихлорацетат (МЭРМТСЛ) подвергался распаду при фотолизе видимым светом с длиной волны 405 нм. Применимость МЭРМТСЛ для детритилирования не была исследована, по-видимому, из-за проблем с его синтезом. Нами был усовершенствован синтез ключевого интермедиа-та МЭРМТСЛ — 4-(4-метоксифенил)-2,6-динит-робензальдегида [6], что позволило исследовать пригодность МЭРМТСЛ для детритилирования в условиях олигодезоксирибонуклеотидного синтеза. Это соединение может оказаться удобным детритилирующим агентом в микрочиповом олигонуклеотидном синтезе, поскольку выделяющаяся при его фотолизе трихлоруксусная кислота обладает минимальной апуринизирующей способностью, а свойство фотогенератора кислоты разлагаться при облучении светом с длиной волны 405 нм позволяет использовать достаточно мощные промышленные лазерные диоды. Кроме того, переход из ближнего ультрафиолета (365 нм), применяемого обычно для фотолиза [3] в более длинноволновую область (405 нм) при генерации кислоты снижает возможность участия растущей олигонуклеотидной цепи в побочных фотохимических реакциях.
ФОТОГЕНЕРАТОР ТРИХЛОРУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ
637
(a) 2
(б)
-C1 C1 C1
Формула. Структура [[4-(4-метоксифенил)-2,6-динитрофенил]-(фенил)-метил]-2,2,2-трихлорацетата (MDPMTCA), использованного в олигонуклеотидном синтезе в качестве фотокислоты.
В модельных опытах установлено, что 5'-0-(4,4'-диметокситритил)-2'-дезокситимидин в концентрации 2 х 10-4 М подвергается количественному детритилированию 2 мМ MDPMTCA в хлористом метилене менее чем за 20 с (рисунок) при облучении светодиодом (Collimated LED Light Source for Leica DMI Microscopes M405L2-C2, ThORLABS) с мощностью излучения 40 мВт/см2.
MDPM-TCA был опробован в качестве деблокирующего реагента в колоночном олигонуклео-тидном синтезе. Синтез целевых олигонуклеоти-дов проводили с использованием модифицированного синтезатора олигонуклеотидов ASM-800 (Биоссет, Россия). Синтезатор был модифицирован для использования полуавтоматического протокола для фотосинтеза олигонуклеотидов в 0.5 ммолярном масштабе на пористом стекле в протоке реагентов. В синтезатор вместо трихлор-уксусной кислоты для деблокирования 5'-тритиль-ной группы помещали 3% раствор MDPM-TCA. Олигонуклеотидный синтез проводили в кварцевых колонках, содержащих пористое стекло CPG с ко-валентно присоединенным первым нуклеотид-ным звеном. Синтезатор был снабжен светодио-дом и оптическим блоком для фокусировки света на реакционную колонку. Детритилирование проводили трехкратно, время экспозиции для каждой порции фотокислоты составляло 1 мин. Все остальные стадии наращивания олигонуклео-тидной цепи при использования фосфорамидитно-го синтеза, включая блокирование непрореагиро-вавших 5'-гидроксильных групп уксусным ангидридом, были неизменны. После завершения синтеза носитель обрабатывали концентрированным раствором водного аммиака в течение 4 ч при 60°C. Реакционные смеси анализировали с помощью
Анализ реакционной смеси при синтезе АААААААА. (а) Электрофореграмма в 20% ПААГ (денатурирующие условия): 1 — ТПТПТПТ (стантарт), 2 — реакционная смесь при синтезе АААААААА, 3 — краситель бромфе-ноловый синий. (б) офВЭЖХ реакционной смеси. Использовали линейный градиент ацетонитрила (2—20%) в 0.05 М триэтиламмоний ацетате (рН 7.5) в течение 10 мин; скорость элюции 150 мкл/мин. Хроматограф Миллихром А-02, колонка Ргоп1х£П-120-5-С18 AQ, размер частиц 5 мкм (б).
3
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ том 40 № 5 2014
638
СИНЯКОВ и др.
ВЭЖХ и гель-электрофореза в ПААГ. Целевые олигонуклеотиды (5'-3'): TGTCCTA, TCTGTCCTA, ATCCTTGGTC, AAAAAAAA, TTTTTTTTTT выделяли с помощью офВЭЖХ.
Строение синтезированных олигонуклеотидов подтверждали масс-спектрометрически на масс-спектрометрометре Agilent 6410 Trip-pleQuadLC/MS (AgilentTechnologies, США) в режиме ESI. MS (ESI) [M - H]: TGTCCTA: вычислено 2069.374, найдено 2069.380; TCTGTCCTA: вычислено 2662.466, найдено 2662.986; ATCCTTGGTC: вычислено 2991.518, найдено 2991.966; AAAAAAAA: вычислено 2441.494, найдено 2441.374; TTTTTTTTTT: вычислено 2977.766, найдено 2977.493.
Выходы на стадию наращивания цепи с использованием фотогенерированной трихлорук-сусной кислоты составили 97%, что является удовлетворительным для твердофазного синтеза.
Следует отметить, что время деблокирования 5'-гидроксильной группы растущей олигонуклео-тидной цепи, необходимое для генерирования трихлоруксусной кислоты из предшественника фотокислоты, диффузии в поры CPG и собственно детритилирования, составляло 3 мин. Можно предположить, что в случае микрочипового синтеза это время будет значительно меньше, вследствие отсутствия диффузионных процессов.
Таким образом, установлено, что [[4-(4-меток-сифенил)-2,6-динитрофенил](фенил)метил]-2,2,2-трихлорацетат может быть успешно использован в
качестве детритилирующего агента для твердофазного олигонуклеотидного синтеза и перспективен для применения в микрочиповом олигонуклео-тидном синтезе.
Работа выполнена при финансовой поддержке междисциплинарного интеграционного проекта СО РАН № 138 "Технологическая платформа для синтетической биологии" и проекта № 24.60 " Разработка метода нефлуоресцентной микрочиповой диагностики" Программы РАН № 24 "Фундаментальные основы технологий наноструктур и наноматериалов".
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Huang Y, Tang H., Duffy S., Hong Y., Norman S., Ghosh M., He J., Bose M, Henrickson K.J., Fan J., KraftA.J., Weisburg W.G., MatherE.L. // J. Clin. Microbiol. 2009. P. 390-396.
2. Borovkov A.Y., Loskutov A.V., Robida M.D., Day K.M., Cano J.A., Le Olson T, PatelH, Brown K, Hunter P.D., Sykes K.F. // Nucleic Acids Res. 2010. V. 38. e180.
3. Gao X., Yu P., LeProust E., Sonigo L., Pellois J.P., Zhang H. // J. Am. Chem. Soc. 1998. V 120. P. 1269812699.
4. LeProust E, Pellois J.P., Yu P., Zhang H, Gao X. // J. Comb. Chem. 2000. V. 2. P. 349-354.
5. Serafinowski P.J., Garland P.B. // Org. Biomol. Chem. 2008. V 6. P. 3284-3291.
6. Николаенкова Е.Б., Оськина И.А., Савельев В.А., Самсонов В.А., Тихонов А.Я., Рябинин В.А., Синяков А.Н. // Журнал органической химии. 2013. Т. 49. С. 11031105.
Photogenerator of Trichloroacetic Acid—A Perspective Detritylation Agent for Microchip Oligonucleotide Synthesis
A. N. Sinyakov*, #, E. B. Nikolaenkova**, I. A. Os'kina**, V. A. Savel'ev**, V. A. Samsonov**, A. Ya. Tikhonov**, M. Yu. Palatkina***, D. E. Zaytsev***
#e-mail: sinyakov@niboch.nsc.ru
*Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, 630090 Russia
**Vorozhtsov Novosibirsk Institute of Organic Chemistry, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, Novosibirsk
***Novosibirsk State University, Novosibirsk
For the purpose of new detritylation agents search for microarray oligonucleotide synthesis we investigated applicability of [4-(4-methoxyphenyl)-2,6-dinitro-phenyl](phenyl)methyl 2,2,2-trichloroacetate for 4,4'-dimethoxytrityl group detritylation during oligonucleotide syntheses generating trichloroacetic acid at radiation by light with a length of wave of 405 nanometers. [4-(4-Methoxyphenyl)-2,6-dinitro-phenyl](phe-nyl)methyl 2,2,2-trichloroacetate has been successfully used for solid-phase oligonucleotide synthesis of desired oligonucleotides.
Keywords:photogenerated acids, trityl cation, oligodeoxyribonucleotides
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ том 40 № 5 2014
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.