БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 2, с. 293-306
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 577.354
ФОТОИНДУЦИР ОВАННЫЕ П P ОЦЕССЫ И РЕАКЦИОННАЯ ДИНАМИКА БАКТЕРИОРОДОПСИНА
© 2015 г. Е.Л. Терпугов, О.В. Дегтярева
Институт биофизики клетки РАН, 142290, ПущиноМосковской области, ул. Институтская, 3
E-mail: olga_degt@mail.ru Поступила в p едакцию 28.01.15 г.
В последние годы накоплено большое количество информации о структуре и динамических свойствах бактериородопсина на атомном уровне с большим временным и пространственным разрешением, которая обобщена во многих обзорах. В обзоре рассмотрены последние достижения в наблюдении фотоиндуцированного поведения бактериородопсина и понимании все еще неясных механизмов ретиналь-белковых взаимодействий. Обсуждаются собственные новые спектроскопические данные, полученные на бактериородопсине дикого типа и на модельных соединениях аминокислот с помощью эмиссионной ИК-Фурье-спектроскопии и спектроскопии в УФ-видимой области. Основываясь на характеристиках структуры и оптических свойствах глицина и лизина, моделирующих фотозависимое поведение опсина в естественных условиях, авторы пытаются найти ответ на один из наиболее важных вопросов, касающихся роли белка в первичных процессах.
Ключевые слова: бактериородопсин, глицин, L-лизин, фотоактивация аминокислот, стимулированная ИК-эмиссия, эмиссионная ИК-Фурье-спектроскопия.
Открытый в 1971-м году фоточувствительный белок архебактерий На1оЪасгвпит salinari-иш, бактериородопсин (БР), относится к семи-членным а-спиральным мембранным белкам, функционирующим как протонная помпа и выполняющим такие биологические функции, как зрение, фототаксис и фотосинтез [1]. Протонная помпа запускается реакцией полностью-транс-13-цис-изомеризацией, которую можно отследить с помощью адсорбционной спектроскопии через образование промежуточных состояний, называемых интермедиатами К, Ь, М, N и О [2,3]. Р еакция фотоизомеризации происходит на временной шкале меньше чем несколько пико-секунд и приводит белок к метастабильному состоянию (К-интер медиат), запасенная энер гия которого в последующем утилизируется в серии термально запускаемых переходов (К ^ Ь ^ М ^ N ^ О ^ Б Р) для достижения специфической функции намного более длительной (~ 15-20 мс) временной шкале.
Бактер иородопсин является одним из самых изученных на сегодняшний день мембранных белков. Он является одним из тех немногих, для которых проведен детальный структур ный и спектральный анализ микро секундных интер-
Сокращения: БР - бактериородопсин, ШО - основание Шиффа, ЖК - жидкие кристаллы, ПШО - протониро-ванное ШО.
медиатов. В последние годы появился ряд обзорных статей [4-6], в которых отображены итоги и прогресс, достигнутый в отслеживании и понимании биологической активности белка на атомном уровне с очень высоким пространственным разрешением.
В настоящее время вполне доказано, что существенной чертой процесса активного переноса протона является фотоизомеризация хро -мофора в фотохимическом цикле и хромофор непосредственно участвует в переносе протона, инициируя цепь превращений в Б Р. Из большого числа накопленных данных следует, что протонный насос включает в себя несколько стадий:
- перено с протона от основания Шиффа на аспартат Л8р85 на Ь^М-переходе;
- выделение протона из комплекса, содержащего глютаминовые остатки в1и194 - в1и204 (так называемый «протонвыделяющий комплекс»);
- перенос протона от Л8р96 на основание Шиффа;
- перенос пр отона из цитоплазмы на Л8р96 происходит при переходе из N в О.
Перено с протона от Л8р85 на протонвыде-ляющий комплекс происходит при переходе от О к Б Р.
П ри пер емещении протона в одном направлении энергия света, запасенная на стадии образования К-формы, распределяется на несколько стадий, что обеспечивает регуляцию сродства о снования Шиффа (ШО), Л8р85 и Л8р96 к пр отону. Реакция изомеризации - переход из полностью-транс- в 13-цис-конформацию - является ключевой в функционировании Б Р. Она является тем самым триггером, который запускает фотоцикл и собственно обусловливает все последующие структурные преобразования в белке.
Совсем недавно казалось, что рассмотренный выше сценар ий функционирования Б Р как протонной помпы является завершенным и область исследований, связанных с бактериоро-допсином, практически исчерпана [4-6]. Необходимо было определить лишь уточняющие детали в работе Б Р, касающиеся времени сверхбыстрой изомеризации и взаимодействия изомер изации с другими сверхбыстрыми процессами, которые были слабо изученными и не позволяли построить единую, не противоречивую реакционную модель. Для решения этой задачи требовалась разработка новых подходов и методов с более высокой чувствительностью и более высоким вр еменнь1 м и пр остранствен-ным р азр ешением.
В этот период часть исследователей сосредоточилась на поиске новых систем, которые могли содержать белки, подобные Б Р. В р е-зультате близкородственные архейным родопсинам белки были обнаружены в гр ибах (Еиса-гуа), эубактериях (Ба^епа) в морском планктоне [7-10]. Оказалось, что фотоциклы новых ретинальсодержащих белков являются сходными с фотоциклом БР дикого типа. Хотя в грибах ретинальсодержащий белок выполняет сенсорную функцию, то в биопланктоне он функционирует как пр отонная помпа. Эти открытия привели к перео смысливанию роли ар-хейных родопсинов (бактериородопсин, гало-родопсин, сенсо рные родопсины I и II), которые, как до недавнего времени полагали, могут выступать в роли источников энергии и фоторецепторов только у узкой группы видов. Открытие же ретинальсодержащих белков у видов, принадлежащих к разным таксонам, показало, что эти белки, будучи ответственными за утилизацию солнечной энергии, могут оказаться важной компонентой всей земной биосферы.
И сследования сверхбыстрой электронной и структурной динамики были продолжены, как только стали доступны лазеры с субпикосекунд-ной длительностью импульса. Результаты последних исследований с использованием сверхбыстрой спектроскопии ретинальсодержащих
белков регулярно рассматриваются в обзор ных статьях [11-14]. В данном обзор е в центр е внимания находятся достижения, касающиеся понимания механизмов фотоактивации белка и хромофор-белковых взаимодействий, которые остаются все еще слабо понятными. И сходя из особенностей строения и электро-оптических свойств БР, мы пытались найти ответ на один из наиболее важных вопро сов, касающихся ро -ли белка в первичных процессах и механизмов, которые могут активировать пер вичные структур ные пер естр ойки в белке.
РАННИЕ СОБЫТИЯ В ФОТОЦИКЛЕ БАКТЕРИОРОДОПСИНА
И МОДЕЛИ ПЕРВИЧНЫ X РЕАКЦИЙ
Первоначальные события в фотоцикле задают напр авление, выход и временную шкалу (от фемто- до пикосекунд) р еакции изомеризации [15-19]. Хотя в большинстве полученных данных существует совпадение по наблюдаемым константам первичных реакций, основные споры ведутся по вопро сам, связанным с вовлечением в фотодинамику элементарных внутри- и межмолекулярных процессов и, соответственно, связанных с этими процессами реак-ционными схемами и молекулярными моделями реакций изомеризации (подробно см. обзоры [11-13] и ссылки в них).
Превалирующая модель ранних реакций ре-тинальсодержащих белков предполагала схему с одномерным профилем потенциальной энергии и эффективной реакционной координатой, связанной с изменением угла поворота вокруг критической двойной СС-связи, упрощенная схема которой выглядит следующим образом:
Ну 500 фс 3 рс БР568 ^ БР* ^ I 625 ^ К 610,
где БР568 соответствует исходному светоадап-тир ованному состоянию Б Р с полностью-транс-изомером ретиналя, БР* - состояние Франка-Кондона в электронном возбужденном состоянии, 1625 и К610 - два интермедиата основного электронного состояния.
Согласно этой модели 1625 ^ К 590 пер еход содер жит в себе два пр оцесса - колебательную релаксацию (так называемое колебательное «охлаждение») и последующие конформационные изменения [20]. На начальном этапе возбуждения хромофора происходит перегруппировка ядер, которая включает в себя торсионное движение по направлению к наиболее подвижному состоянию, приводящее к тому, что хромофор в возбужденном состоянии частично (~90°) закручивается относительно координаты
С13=С14) [21]. Из возбужденного электронного состояния (БР*) помимо флуоресценции совершается переход в основное состояние по двум путям: с образованием батопродукта - изоме-ризованного ^25 интермедиата и, соответственно, путь, по которому возбужденная молекула возвращается в исходное, неизомеризованное состояние БР568. При этом предполагается, что в 1б25 состоянии 13-цис-изомер изация завершается и хр омофор закручен уже на ~180°. Таким обр азом, инициация полностью-транс^13-цис-изомер изации считается самым первым следствием поглощения света.
Однако улучшенное временное разрешение в кинетических экспериментах показало, что происходит активация не только торсионного, но и высокочастотного, связанного с растяжением валентной С=С-связи колебания, что привело к появлению модели двух состояний/двух мод [22]. Доминирующее положение в этой модели занимает предположение об изменении порядка С=С-связи, которое связано с п ^ п*-переходом. Активация двух мод происходит на разной временной шкале: р елаксация возбужденного состояния акцептирующей С=С-моды происходит за первые 50 фс, тогда как связанное с первоначальным р астяжением длины С=С-связи торсионное движение занимает 0,40,5 пс [23]. Эта модель дает самое простое описание изомеризационного процесса, и в настоящее время она наиболее широко принята и используется не только в теоретических подходах квантовой химии, но также для интерпретации экспериментальных данных в электронных и колебательных спектрах.
Последующие эксперименты с использованием методов резонансного комбинационного рассеяния и спектроскопии когерентного ан-тистоксова рассеяния света представили веские доказательства важности колебаний метильных групп (так называемые НООР-колебания) в течение времени жизни возбужденных состояний [24-26], что привело к уточнению рассмотренной выше модели и появлению улучшенной модели двух состояний/трех мод. Инт
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.