УДК 579.873.6.017.7
ФОТОЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ АКТИВАЦИЯ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ СВЕТОКОРРЕКТИРУЮЩЕЙ ПЛЕНКИ
Дмитрий Александрович Филатов,
кандидат биологических наук, научный сотрудник Лидия Ивановна Сваровская, кандидат биологических наук, доцент, старший научный сотрудник Варвара Сергеевна Овсянникова, кандидат химических наук, младший научный сотрудник Институт химии нефти СО РАН пр. Академический, 4, г. Томск, 634021, Россия
В лабораторных условиях исследовано влияние света, моделирующего солнечный спектр, трансформированного светокорректирующей пленкой, на динамику роста и ферментативную активность углеводороокисляющих микроорганизмов рода Pseudomonas. Эксперимент проведен в жидкой среде, загрязненной нефтью в концентрации 2 %. В условиях применения светокорректирующей пленки, как укрывного материла, численность исследуемых микроорганизмов возрастает в 40 раз. Активность дегидрогеназы и каталазы увеличивается в 2-2.5 раза соответственно. Динамика накопления альдегидов как промежуточных продуктов метаболизма при микробном окислении углеводородов возрастает в 2.5 раза. При этом процессы биохимического окисления нефти протекают в 5 раз быстрее, по сравнению с контрольными вариантами.
Ключевые слова: углеводородокисляющие микроорганизмы, светокорректирующие пленки, дегидрогеназа, каталаза, фотолюминесцентная активация.
Проблема светочувствительности микроорганизмов привлекает все большее внимание исследователей. В настоящее время достигнуты значительные успехи в изучении механизмов ряда фотобиологических процессов [1]. Установлено также, что все растения и водоросли характеризуются наличием специальных фоторегуляторных систем, эффективно контролирующих их рост и развитие [2]. Однако в литературе имеется очень мало данных об эффектах и механизмах действия света на метаболизм гетеротрофных микроорганизмов. Исследование регуляторного действия света на жизнедеятельность микроорганизмов является одной из актуальных проблем современной фотобиологии. Сам факт существования фоторегуляторных систем у высших растений позволяет сделать вывод о том, что такого рода системы и механизмы должны существовать и у более древних в эволюционном отношении микроорганизмов [3, 4, 5].
В последние годы особое внимание привлекают светокорректирующие пленки, применяемые для повышения урожайности сельскохозяйственных культур [6, 7]. Влияние пленок на развитие растений связывается с закономерным изменением количественного и качественного состава проходящего через них электромагнитного излучения солнца, а именно поглощение ультрафиолетовой составляющей и трансформацией ее в красную область спектра [8]. Ранее нами было показано, что солнечный свет, трансформированный фотолюминофорами при прохождении через светокорректирующую пленку, стимулирует процессы роста и оксигеназную активность аборигенной почвенной микрофлоры, в процессах биодеградации нефти [9].
Стимулирующее влияние солнечного света при прохождении через светокорректирую-щие полиэтиленовые пленки на рост и биохимическую активность микроорганизмов может иметь различную природу, и механизм такого действия до конца не ясен. Считается, что све-топрозрачные полимерные пленочные материалы с включением люминисцирующих соединений преобразуют часть ультрафиолетовой составляющей солнечной радиации в видимое длинноволновое излучение красной области спектра, что оказывает непосредственное влия-
ние на процессы жизнедеятельности микроорганизмов: увеличение числа бактериальных клеток, синтез ДНК, РНК и белка [10, 11].
Целью настоящей работы являлось исследование стимулирующего влияния света трансформированного светокорректирующей пленкой, на динамику численности и биохимическую активность микроорганизмов в процессе окисления нефтяного загрязнения в жидкой среде.
Материалы и методы исследования
Эксперимент проводили в лабораторных условиях. В качестве жидкой фазы использовали минеральную среду Раймонда для культивирования углеводородокисляющих микроорганизмов. Культивирование проводили в эксикаторах объемом 1000 мл, содержащих 300 мл среды и 2 % по объему нефти Лас-Еганского месторождения. Среду инокулировали микробной взвесью, содержащей 2 вида углеводородокисляющих бактерий рода Pseudomonas, выделенных из пластовой воды этого же месторождения.
В опытном варианте емкость с культуральной средой закрывали светокорректирующей пленкой марки ФЕ, содержащей в качестве люминофора комплекс нитрата европия и фенан-тролина с максимумом люминесценции 615 нм. В качестве контроля использовали эксикаторы закрытые обычной пленкой ПЭВД (полиэтилен высокого давления) и закрытые стеклянной крышкой, помещенные в темное место, без освещения. Источником освещения служил совмещенный спектр двух ламп: люминесцентной лампы ЛБ-40 и УФ лампы «PHILIPS BLACK LIGHT». Лампа ЛБ-40 моделирует солнечный спектр 380-710 нм в области фотоактивной радиации, интенсивность облучения 29 Вт/м2. УФ лампа моделирует УФ часть солнечного спектра с максимумом излучения 365 нм, мощность 9 Вт, интенсивность облучения 4 Вт/м2. Режим облучения - 6 часов в сутки. Продолжительность эксперимента 15 суток при температуре 18-20 °С. Повторность измерений в экспериментах трехкратная при постановке трех независимых серий опытов. Представленные результаты отражают усредненные величины.
На протяжении всего эксперимента через каждые 2-3 суток определяли ферментативную активность, динамику численности микроорганизмов и динамику накопления альдегидов, как промежуточных продуктов метаболизма.
Численность клеток определяли по их колониеобразующей способности (КОЕ/мл). При этом использовали метод предельных разведений с высевом на мясо-пептонный агар (МПА) в чашки Петри. Культуру инкубировали в термостате при 28 °С в течение восьми суток [12].
Каталазную активность контрольных и опытных образцов определяли газометрическим методом, дегидрогеназную - фотоколориметрическим методом [12, 13].
Содержание альдегидов в культуральной среде определяли по изменению оптической плотности среды в процессе культивирования микроорганизмов в контакте с нефтью с использованием реактива на основе фуксина [14].
Содержание индивидуальных углеводородов исходной нефти и после биодеградации определяли на газо-жидкостном хроматографе 3700 с пламенно-ионизационным детектором и капиллярной колонкой с неподвижной фазой SE 54 длиной 25 м. ИК-спектры остаточных углеводородов нефти снимали на спектрометре Фурье NIKOLET 5700 (FT-IR) и сравнивали со спектрами исходного загрязнения. Элементный состав нефтей (углерод, водород, сера, азот и кислород) определяли традиционными методами [15].
Результаты и обсуждения
Результаты опытов показали, что при облучении ассоциации углеводородокисляющих микроорганизмов рода Pseudomonas светом, трансформированным светокорректирующей пленкой марки ФЕ, их численность увеличивается в 40 раз на 7-9 сутки культивирования, т.е. фактически происходит фотостимуляция роста и размножения микробных клеток. Применение светокорректирующей пленки сокращает период лаг-фазы и вызывает экспоненциальный рост бактериальных клеток.
Максимальная численность наблюдается на 9 сутки и составляет 2290х106 КОЕ/мл соответственно. В контрольных вариантах численность бактерий не превышает 60х106 КОЕ/мл (рис. 1).
Контроль (без освещения) Контроль (пленка ПЭВД) Опыт (пленка ФЕ)
Рис. 1. Динамика численности микроорганизмов при облучении светом, трансформированным светокорректирующей пленкой ФЕ. Контроль пленка ПЭВД и без освещения
Вполне вероятно, что один из центральных элементов системы регуляции жизнедеятельности микроорганизмов, в норме функционирующей вне зависимости от наличия квантов света, в силу особенностей своего строения обладает светочувствительностью и относится к фотохромам - молекулам, способным менять свою пространственную конфигурацию при поглощении кванта света. В этом случае свет вызывает определенные изменения в программе регуляции метаболизма, возможно, путем фотоиндуцированного синтеза биологически активных соединений типа индуктора или репрессора, присутствие которых вызывает индуцированный автосинтез у дочерних клеток с соответствующим ускорением темпов, развития [10].
Также имеются данные, что при облучении прокариотических клеток (например Escherichia coli) красным монохроматическим светом, фотоакцепторами являются терминальные ферменты дыхательных цепей (например цитохром-с-оксидаза), а качестве механизма рассматривается изменение скорости потока электронов внутри оксидазных комплексов, что приводит к значительным изменениям в параметрах клеточной мембраны и функционирования ряда генов. Предполагается, что красный свет, абсорбированный хромофорами в дыхательной цепи, усиливает дыхательный метаболизм и воздействует на электрогенные свойства ее мембраны [1].
Вероятно, снижение общей численности микроорганизмов на 11-15 сутки связано с накоплением продуктов распада при биохимическом окислении углеводородов (рис. 1).
Ферменты каталаза и дегидрогеназа относятся к группе оксигеназ, которые катализируют окислительно-восстановительные процессы и трансформацию отдельных групп органических соединений.
На рисунке 2 (а) представлена динамика образования кислорода, которая отражает активность каталазы при фотостимулировании светом, трансформированным люминофорами плёнки ФЕ. Высокоактивный кислород, образующийся при участии каталазы, обеспечивает доступным кислородом микроорганизмы, участвующие в процессах разложения органики. Каталаза входит в состав дыхательных ферментов. С ее участием, кроме образования кислорода, происходит окисление первичных спиртов и синтез энергетических материалов (АТФ), расходуемых для процессов синтеза в клетке. В опытном варианте активность каталазы увеличивается в 2.5 раза.
Дегидрогеназы также входят в состав дыхательных ферментов и катализируют реакцию дегидрирования (отщепления водорода). Они являются важнейшими деструкторами органического вещества, в том числе углеводородов нефти. На рисунке 2 (б) показано, что при освещении светом, трансформированным светокорректирующей пленкой, активность
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.