БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 5, с. 898-905
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =
УДК 577.3
ФОТОРЕАКТИВИ РУЮЩАЯ АКТИВНО СТЬ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ: РЕПАРАЦИЯ УФ-ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК Escherichia coli С УЧАСТИЕМ lux -ГЕНОВ МОРСКИХ БАКТЕРИЙ
© 2015 г. Г.Б. Завильгельский*, О.Е. Мелькина*, В.Ю. Котова*, М.Н. Коноплева**, И .В. Манухов* **, К.С. Пустовойт*
Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов («ГосНИИгенетика»), 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1; **Московский физико-тех нический институт (государственный университет), 141700, Долгопрудный Московской области, Институтский пер., 9 E-mail: zavilgel@genetika.ru Поступила в p едакцию 20.05.15 г.
УФ-резистентность люминесцирующих бактерий Escherichia свИ AB1886 uvrA6 (pLeol), содержащих плазмиду с генами luxCDABE морской бактерии Photoba£terium leiognathi, примерно в два раза превышает УФ-резистентность несветящихся бактерий E. свИ AB1886 uvrA6. Введение в геном E. свИ AB1886 uvrA6 ^Leol) мутации р^::капг (дефект функциональной активности фотолиазы) полностью снимает повышенную УФ-резистентность клеток. Следовательно, основной вклад в индуцируемую биолюминесценцией репарацию ДНК вносит бактериальная фотолиаза, осуществляющая фотореактивацию. Показано, что фотореактивирующая активность биолюминесценции Phвtвbacterium leiognathi примерно в 2,5 раза ниже по сравнению таковой, индуцируемой источником света с X > 385 нм. Показано, что индуцируемое УФ -излучением в бактериальных клетках E. свИ с плазмидами, содержащими гены lux CDABE под R^A-LexA-регулируемыми промоторами, нарастание интенсивности биолюминесценции происходит лишь через 25-30 мин после УФ -облучения клеток и не способствует репарации ДНК. Quorum sensing регуляция также не способствует репарации ДНК с помощью фотолиазы.
Ключевые слова: биолюминесценция, фотолиаза, фотореактивация, SOS-индукция, quorum sensing.
П роисхождение бактериальной биолюминесценции остается загадкой. В настоящее вр е-мя рассматр иваются несколько концепций про -исхождения и роли бактериального свечения в экологии современной морской фауны: 1) бактериальные люциферазы могут быть включены в процессы детоксификации активных форм ки-слор ода (АФК), что опр еделяло защиту бактерий от АФК особенно на ранних стадиях эволюции при низких концентрациях кислорода в атмосфере [1-3], 2) биолюминесценция способствует р епа рации ДНК, что дает клеткам дополнительную защиту от летального действия коротковолнового солнечного ультрафиолетового (УФ) света [4-6], 3) свечение бактерий в комплексе с питательными веществами служит приманкой и способствует более эффективному использованию продуктов питания в качестве пищи эукариотическим организмам (зоопланктон, рыбы), так называемая «bait hupothesis»
Сокращения: АФК - активные формы кислорода, УФ -ультрафиолетовый.
[7-10]. В работе [11] было показано, что морские бактерии различных видов (Vibrio harveyi, Ali-ivibrio fis^eri, Photobacterium leiognathi, Photo-ba£terium phosphoreum) более чувствительны к УФ -облучению по сравнению с клетками дикого типа, если содержат мутации в генах lux -оперона. Было предположено, что биолюминесценция активирует фотореактивирующий фермент (фотолиазу), которая мономеризует циклобутановые пиримидиновые димеры в ДНК. Однако в работе [12], проведенной на морских бактериях Aliivibrio fis^eri ES114, со -держащих мутацию в гене рhr (кодирует фотолиазу) или делецию генов lux CDABEG, показано, что биолюминесценция не активирует фотолиазу, а добавление к дикому штамму ауто-индуктора N-3-оксогексаноил гомосерин лак-тона (3-oxo-C6-HSL), повышая УФ-резистент-ность клеток, не зависит как от наличия активной фотолиазы, так и от интенсивности свечения.
Вызывает сомнение важность в процессе эволюции свечения у морских бактерий участия
биолюминесценции в pепарации ДНК в связи с низкой интенсивностью свечения при концентрациях бактер ий, хар актерных для планктона и не превышающих критическую концентрацию, при котор ой ср абатывает система Quorum Sensing (QS) [13]. В работе [5] было предполо-жено, что коротковолновой УФ (200-300 нм), индуцируя в клетках планктона, содержащих lux-гены, кодирующие люциферазу, SOS-ответ и усиление интенсивности биолюминесценции, в результате активирует фотолиазу. Однако доказательств участия SOS-индуцируемой биолюминесценции в репарации ДНК в работе [5] представлено не было.
Поэтому мы в настоящей работе провели анализ влияния интенсивности биолюминесценции на репарацию ДНК на модели бактерий Escherichia coli с использованием гибридных плазмид, содержащих гены lux-оперонов различных светящихся бактерий, расположенных как под промотор ом системы QS, так и под УФ -индуцируемыми SOS-промотор ами. В р а -боте использовали, наравне с диким штаммом E. coli, штаммы, содержащие мутации в генах uvrABC (дефект темновой эксцизионной репа-рации), lex A, recA (дефект SOS-индукции), phr (отсутствие активной фотолиазы), а также в гене lonA (дефектная протеаза La (Lon)). Мутант E. coli lonA характеризуется значительным усилением экспрессии lux-генов в связи с отсутствием деградации белка LuxR, активатора транскрипции системы QS [14,15].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериальные штаммы и плазмиды. Использовали штаммы Escherichia coli K-12: AB1157 F- thr-1, leu-6, proA2, his-4, thi-1, argE3, lacY1, galK2, ara14, xyl-5, mtl-1, tsx-33, rpsL31, supE44; AB1886 uvrA6, AB2494 lexA1, AB2463 recAl (остальные маркеры у штаммов AB1886, AB2494, AB2463, как у AB1157) - все штаммы получены из коллекции «ГосНИИгенетика».
E. coli AB1886 uvrA6 phr::kan (перенесен с помощью Р1 трансдукции из генома E. coli JW0698 А (araD-araB) 567 AlacZ4787(::rrnB-3) Aphr-758::kan л- rph-1 А (rhaD-rhaB) 568 hsdR514 (Keio соПесНо^.
В работе использовали плазмиды: pLeo1, pLeo3, pXen7, pOM, pF1, p^lD'::^:
- pLeol - вектор pUC18 содержит гены luxCDABE P. leiognathi, расположенные как под собственным промотором, так и под lac-про-мотором вектора pUC18;
- pLeo3 - вектор pUC18 содержит под lac-промотором гены lux ABE P. leiognathi [16];
- pXen7 - содержит в вектор е pUC18 гены luxCDABE Photorhabdus luminescens, расположенные под собственным нативным промотором [17];
- рСоШ::1их - содержит гены lux CDABE Photorhabdus luminescens, расположенные под SOS-промотором гена cda из плазмиды pColD-CA23 [18];
- рОМ Cmr- содержит в вектор е pACYC184 встроенный BamHI/NruI фрагмент ДНК A. fis-cheri из плазмиды pF1 (lux ICDABEG) под про -мотором Pr и регуляторную область ДНК между генами luxR и luxI (без гена luxR) [19];
- pF1 - содержит в векторе pBR322 встро -енный по сайтам BamH1 полный lux-регулон lux RIABCDE морских бактерий Aliivibrio fischeri (ранее Vibrio fischeri) [20].
Трансформацию бактериальных клеток про -водили с помощью электропорации.
Среды, ферменты, реактивы. Для роста бактерий использовали L-бульон и L-агар плюс антибиотики: ампициллин (100 мкг/ мл), кана-мицин (40 мкг/мл), хлорамфеникол (20 мкг/мл). Митомицин C и аутоиндуктор N-3-оксогекса-ноил гомосерин лактон получены от Sigma Che-mkal Co (ОТА).
Ферменты для работы с ДНК получены от Fermentas (Литва).
УФ-облучение и фотореактивация бактерий. Бактерии, выросшие с аэрацией до OD = 0,2-0,3, дважды отмывали 0,02 М трис-НО-буфером (0,02 М трис-HCl, 0,01 М NaCl, pH 7,8), переводили в фосфатный буфер и облучали при комнатной температуре различными дозами УФ -света (X = 254 нм). Источником коротковолнового УФ -света служила бактерицидная лампа БУВ-30. Дозу УФ-света измеряли при помощи УФ-дозиметра с магниевым фотоэлементом (УФД-4). Выживаемость бактерий определяли путем высева на чашках Петри двуслойным методом: для верхнего и нижнего слоев чашек Петри использовали 1,8%-й и 0,7%-й LB-агар.
И сточником фотореактивирующего света служила ртутная лампа высокого давления CВД-120А с фильтром ЖC-4, пропускающим свет с X > 385 нм. Фотореактивацию бактерий проводили в фосфатном буфере в течение 20 мин при 37 °C.
Измерение SOS-ответа. Гибр идные плазмиды pXen7, р^Ш^их и рОМ вводили трансформацией в клетки штаммов E. coli AB 1157 uvr+ и AB 1886 uvrA6. Бактерии E. coli AB 1157 uvr+ и AB 1886 uvrA6, содержащие плазмиды pXen7, р^Ш^их или рОМ, выращивали с аэрацией при 30°C 18 ч.
0 3.5 7.0 10.5 14.0 17.5 0 10"6 10"5 10"4 10"3
Доза УФ, Дж/м2 [Митомицин С], М
Pте. 1. (а) - Кpивые выживаемости бактерий E. coli AB 1886 uvrA6 (темновой вариант) и AB 1886 uvrA6 (pLeol) (световой вариант) в зависимости от дозы УФ-облучения (254 нм). На рис. 1а также представлены кривые выживаемости бактерий при УФ -облучении штаммов E. coli AB1886 uvrA6 ^Leo3), E. coli AB1886 uvrA6 phr::kanr ^Leo1), а также штамма E. coli AB1886 uvrA6, котор ые после УФ -облучения были фото р еактивир уемые пр и помощи света (Я > 385 нм). Темные квадр аты - E. coli AB 1886 uvrA6 (темновой вар иант); кр ужки - E. coli AB1886 uvrA6 ^Leo1) (световой вар иант); светлые квадр аты - E. coli AB1886 uvrA6 ^Leo3); кр естики - E. coli AB1886 uvrA6 phr::kanr ^Leo1); треугольники - E. coli AB1886 uvrA6 + освещение фотореактивирующей лампой C ВД-120А с фильтр ом Ж C-4. Фотор еактивацию пр оводили в фосфатном буфер е 20 мин пр и 37°C. (б) - К р ивые выживаемости бактер ий E. coli AB 1886 uvrA6 (темновой вар иант) и AB 1886 uvrA6 ^Leo1) (световой вар иант) пр и обр аботке бактер ий митомицином C, котор ый индуцирует в ДНК нефотор еактивируемые моноаддукты. Штаммы AB1886 и AB1886 ^Leo1) характеризуются равными параметрами чувствительности к митомицину C. Темные квадр аты - AB 1886; светлые квадр аты - AB1886^Leo1).
Затем ночную культуру р азводили до концентр ации 107 кл/мл свежей LB и выр ащивали с аэр ацией пр и 30° 2-3 ч до OD = 0,2 - 0,3. После УФ -облучения пр обы из фо сфатного буфер а пер еводили в LB и по 200 мкл пер ено сили в кюветы, одна из котор ых содер жала необлу-ченные клетки и служила контр олем, и располагали перед фотоумножителем в люминометре LMAO1 (Beckman, CША) пр и комнатной темпер атуре. Через определенные интервалы времени у обр азцов измер яли интенсивно сть биолюминесценции.
Индукция QS-еиетемы. Для измер ения влияния активности системы QS на УФ -защи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.