ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 416, № 3, с. 408-411
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 581.174.1
ФОТОСЕНСИБИЛИЗИРОВАННОЕ КАРОТИНОИДАМИ ОКИСЛЕНИЕ ДИМЕРОВ БАКТЕРИОХЛОРОФИЛЛА СВЕТОСОБИРАЮЩИХ КОМПЛЕКСОВ В800-850 В КЛЕТКАХ ALLOCHROMATIUM
MINUTISSIMUM © 2007 г. 3. К. Махнева, Ю. Е. Ерохин, А. А. Москаленко
Представлено академиком В.А. Шуваловым 18.01.2007 г. Поступило 07.02.2007 г.
Фотосинтезирующие бактерии имеют наиболее простую светособирающую систему. Она состоит из двух типов антенных комплексов (периферийного В800-850 и прицентрового В880). Эти комплексы содержат два основных типа пигментов: бактериохлорофилл и каротиноиды [1]. Пигменты класса хлорофилла (бактериохлорофилл) являются основными пигментами в фотосинтетической мембране, участвуя как в поглощении энергии света, так и в разделении зарядов. Каротиноиды считаются дополнительными пигментами и в фотосинтезе выполняют несколько важных функций, в частности: светособирающую (поглощение энергии света и ее передача к бактериохло-рофиллу), защитную (предотвращение взаимодействия кислорода и бактериохлорофилла, с окислением последнего) и структурную (стабилизация структуры светособирающих комплексов) [2, 3]. Все эти функции направлены на поддержание оптимальных характеристик как световой стадии процесса фотосинтеза, так и структур, в которых протекают эти стадии фотосинтеза. В литературе отсутствуют сведения о том, что свет, поглощаемый каротиноидами, может отрицательно влиять на процессы световых стадий фотосинтеза или приводить к деструкции отдельных компонентов пигмент-белковых комплексов. В данной работе представлены результаты по фотоокислению ди-меров бактериохлорофилла, сенсибилизированному светом, поглощаемым каротиноидами, непосредственно в клетках бактерий АПосЬгота-йит (А1с.) minutissimum.
Клетки А1с. minutissimum (старое название СИготайит minutissimum) выращивали, как описано ранее [4, 5]. В экспериментах использовали нормальные клетки и клетки, в которых ингиби-ровали биосинтез каротиноидов, добавляя в среду выращивания дифениламин (12 мг/л) [5]. Во вто-
Институт фундаментальных проблем биологии Российской Академии наук, Пущино Московской обл.
ром случае были получены клетки, содержание каротиноидов в которых составляло <3-5% от контроля. Хроматофоры выделяли после разрушения клеток ультразвуком с помощью дифференциального центрифугирования [4, 5]. Спектры поглощения образцов и изменения в спектрах поглощения после облучения светом записывали на спектрофотометре UV-160 ("Shimadzu", Япония). Их перевод в цифровую форму проводили с помощью АЦП EL24L (фирма "Л-Кард", Россия) непосредственно в процессе измерения программой PowerGraph (www.powergraph.ru). Обработку спектров и подготовку рисунков осуществляли по программе Origin. В качестве источника интенсивного света использовали диапроектор ЛЭТИ с лампой накаливания 300 Вт. Для выделения синей области спектра (415-573 нм) применяли фильтры СЗС22 и ЖС12, а красной области (к > 580 нм) - фильтр КС-10. Перед стеклянным фильтром помещали 1-см водный фильтр, а кювету с образцом помещали в термостатируемую ячейку с внешней водяной "рубашкой" толщиной 0.5 см, через которую постоянно циркулировала вода температурой 23°C. Интенсивность светового пучка, измеренная с помощью пирометра, составляла 0.4, 0.2 и 0.8 Вт/см2 для красного, синего и белого света соответственно. Она в несколько раз выше интенсивности, используемой при выращивании бактерий. При таких интенсивностях света мономерный бактериохлорофилл (основной максимум поглощения при 780 нм) в смеси ацетон/метанол (7/2) выцветал полностью за 10-12 мин. Клетки Alc. minutissi-mum в трис-НС1-буфере (50 мМ, pH 8.0) освещали непосредственно в 1-см спектрофотометриче-ской кювете в присутствии кислорода воздуха. Для предотвращения оседания клеток их суспензию непрерывно перемешивали. Концентрацию контрольных клеток и клеток с ингибированным синтезом каротиноидов нормировали по длинноволновому максимуму комплекса В800-850 в ближней инфракрасной области при 865 нм. В работе использовали трис фирмы "Sigma" (США), доде-
А А
нм
Рис. 1. Разностные спектры поглощения (образец после 60 мин освещения минус контрольный образец): а - клеток А1с. minutissimum (белый свет); б: 1 - контрольных клеток А1с. minutissimum (красный свет); 2 - клеток А1с. minutissi-тит с ингибированным синтезом каротиноидов (белый свет; спектр смещен на -0.05 для большей наглядности). Вставка: фрагменты разностных спектров клеток А1с. minutissimum (1, полный спектр: рис. 1а) и мембран А1с. ттШ;-issimum при их химическом окислении 3 мМ феррицианидом калия (2).
цилмальтозид фирмы "Anatrace" (США), остальные реактивы отечественного производства квалификации "хч".
Бактерия Alc. minutissimum относится к так называемой спириллоксантиновой группе бактерий и в норме содержит основные каротиноиды спи-риллоксантин (25%) и родопин (41%), а также в небольших количествах ликопин и ангидрородо-вибрин. При выращивании клеток этой бактерии в присутствии ингибитора каротиноидгенеза дифениламина происходит подавление синтеза окрашенных каротиноидов на 95-99%. Анализ каротиноидного состава этих образцов показывает, что в них в следовых количествах содержатся нейроспорин, Z-каротин и их производные. Кроме них в клетках присутствуют также так называемые "предшественники" - фитоин и фитофлуин [4, 5]. Таким образом, контрольные клетки и клетки с ингибированным синтезом каротиноидов являются очень удобным объектом для исследования функций каротиноидов in vivo. Клетки представляют достаточно сложную систему, которая может неадекватно реагировать на любое воздействие. Поэтому исследования стараются проводить на более простых объектах, таких, как мембраны или выделенные из них пигмент-белковые комплексы [1]. В данной работе учитывалась высокая лабильность бескаротиноидных
мембран и комплексов, которые выделяются из клеток А1с. minutissimum с ингибированным синтезом каротиноидов. Ранее мы показали, что такие комплексы легко разрушаются при обработке неионными детергентами или при высокой температуре [6]. Поэтому была исследована фотостабильность комплексов непосредственно в клетках. На рис. 1а приведен разностный спектр изменений, которые происходят в контрольных клетках А1с. minutissimum после освещения 60 мин белым светом. Отмечено быстрое уменьшение длинноволновой полосы при 863 нм (димер бактериохлорофилла) комплекса В800-850. Полоса поглощения мономерного бактериохлорофилла (БХЛ) этого комплекса (максимум при 807 нм) практически не изменялась, а полоса поглощения комплекса В880 (максимум при 890 нм) уменьшалась незначительно. Одновременно с уменьшением полосы димера БХЛ наблюдалось увеличение поглощения полосы при 829 нм. Ранее похожие изменения (уменьшение интенсивности полосы поглощения димера БХЛ и одновременное появление полосы поглощения при 830 нм) были выявлены при обратимых конфор-мационных переходах в комплексе В800-850 [6, 7]. Однако, поскольку интенсивность полосы выцветания димера (минимум при 864 нм) более чем в два раза превышала интенсивность полосы мак-
410
МАХНЕВА и др.
симума при 829 нм, то конформационный переход сопровождался еще и окислением димеров БХЛ. Об этом также свидетельствует уменьшение ин-тенсивностей полос поглощения Qx-переxода БХЛ при 590 нм и Соре БХЛ при 375 нм и одновременное появление максимума при 702 нм, который соответствовал окисленному продукту бХл. Дополнительные эксперименты показали, что спектр поглощения продукта химического окисления в мембранах А1с. ттииввтит практически совпадал со спектром фотоокисленного БХЛ (рис. 1а, вставка). Существенно, что при облучении клеток в течение 60 мин каротиноиды (область поглощения 400-550 нм) практически не выцветали (рис. 1а).
Таким образом, в контрольных клетках А1с. ттийввтит под действием белого света происходило только окисление димеров БХЛ (полоса поглощения при 863 нм) комплекса В800-850. В нем присутствуют два типа пигментов - БХЛ и каротиноиды. Эффективность передачи энергии от каротиноидов к БХЛ не превышает 30% [1, 6]. Поэтому естественно было предположить, что при облучении нормальных клеток А1с. ттииввь тит белым светом димеры БХЛ комплекса В800-850 окислялись под действием поглощаемого ими света, т.е. в основном под действием красного света. Можно было также ожидать, что небольшой вклад в этот процесс вносит свет, поглощаемый каротиноидами. Однако анализ действия красного и синего света на нормальные клетки А1с. ттийввтит не подтвердил этих предположений. Из рис. 16 (спектр 1) следует, что эффективность действия красного света меньше в 3.6 раза по сравнению с белым светом. Одновременно под действием красного света изменился характер выцветания пигментов в контрольных клетках А1с. ттийввтит. Появилось плечо в области 890 нм, свидетельствующее о выцветании полосы поглощения комплекса В880. Практически сравнялись (учитывая вклад полосы комплекса В880) амплитуды отрицательной (866 нм) и положительной (837 нм) составляющих действия красного света на комплекс В800-850, что может свидетельствовать только о конформационном переходе в комплексе. Отсутствие полосы поглощения окисленного продукта подтверждает факт, что процесс фотовыцветания на красном свету протекает по-другому, чем на белом. Очевидно, что изменения в спектре поглощения контрольных клеток А1с. ттийввтит на белом свету могут быть связаны только с действием его синей составляющей. Действительно, при освещении таких клеток синим светом были выявлены точно такие же изменения, как и на белом свету, но с несколько меньшей амплитудой (90% от белого света), несмотря на то, что интенсивность синего света была в четыре раза меньше, чем интенсивность белого света. Этот факт свидетельствует о том, что с помо-
щью фильтров СЗС22 и ЖС12 удается практически полностью выделить активную составляющую белого света. Процесс являлся кислородзависимым и в анаэробных условиях выцветания димеров БХЛ комплекса В800-850 не наблюдалось.
Для того чтобы оценить реальный вклад каротиноидов в фотоокисление димеров БХЛ в комплексе В800-850, было проведено изучени
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.