БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 2, с. 152 - 155
ПИСЬМА РЕДАКТОРУ
УДК 577.175.82
ФРАГМЕНТЫ 183 - 198 И 125 - 145 а-СУБЪЕДИНИЦЫ НИКОТИНОВОГО АЦЕТИЛХОЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА Torpedo californica СВЯЗЫВАЮТ а-БУНГАРОТОКСИН И НЕЙРОТОКСИН II Naja naja oxiana
© 1995 г. О. Клукас, И. А. Пешенко*, И. JI. Родионов*, О. В. Телякова,
Ю. Н. Уткин, В. И. Цетлин
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова РАН, Москва; * Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова РАН, Пущино
Поступило в редакцию 08.07.94 г.
Ключевые слова: ацетилхолиповый рецептор, фрагменты (Х-субъединицы, нейротоксины, связывание.
Никотиновый ацетилхолиновый рецептор в настоящее время - один из наиболее исследованных рецепторных белков, чему в немалой степени способствовало наличие таких высокоспецифичных и эффективных лигандов, как нейротоксины змей. Однако, несмотря на широкое использование нейротоксинов для исследования рецептора, механизм их взаимодействия с этим белком до сих пор не совсем ясен. Так, известно, что изолированная а-субъединица ацетилхолино-вого рецептора обладает способностью связывать нейротоксины, хотя и с меньшим сродством, чем природный рецептор [1]. Токсинсвязываю-щие свойства обнаружены также у синтетических пептидов, отвечающих различным участкам а-субъединицы. В зависимости от природы использованного нейротоксина и метода тестирования обнаружено связывание со следующими фрагментами а-субъединицы ацетилхолинового рецептора: 1 - 16 [2, 3], 23 - 60 [2, 3], 55 - 74 [4, 5], 122 - 150 [2, 3] и 180 - 200 [2 - 4, 6 - 7].
Большинство исследователей сходится во мнении, что основной участок связывания токсинов расположен в области 180 - 200, а наиболее противоречивая информация получена об участке 122 - 150. Так, Атасси и сотр. [3] считают, что именно область а 122 - 138 образует главный ток-синсвязывающий домен, однако другие авторы не смогли обнаружить взаимодействия а-бунгаро-токсина с этой областью а-субъединицы [8 - 10]. Следует отметить, что в большинстве перечисленных работ использовали именно а-бунгаро-токсин, принадлежащий к группе постсинаптиче-ских нейротоксинов так называемого длинного типа (см. классификацию нейротоксинов в [11]).
Адрес для корреспонденции: 117871, ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10, ИБХ РАН, Ю.Н. Уткину.
Поскольку в проводимых в нашем институте исследованиях пространственной структуры нейротоксинов [12, 13] и топографии их взаимодействия с нативным ацетилхолиновым рецептором (совместная работа с проф. Ф. Хухо, Свободный университет Берлина) [14] основным объектом является нейротоксин II Naja naja oxiana, т.е. ней-ротоксин короткого типа, целью данной работы стала проверка его способности связываться с фрагментами а-субъединицы рецептора. В этой же серии опытов параллельно проводился анализ связывания а-бунгаротоксина.
Для исследования использовали синтетические пептиды, соответствующие фрагментам 186 - 198 и 183 - 198, из области а 180 - 200, a также фрагмент 125 - 145 из области а122 - 150. Пептиды синтезировали твердофазным методом (Ртос//Ви-стратегия) на смоле Ванга (0.54 мг-экв. гидроксильных групп/г смолы, 1% сшивки, Vega, USA), все конденсации осуществляли методом активированных (пентафторфениловых) эфиров в присутствии гидроксибензотриазола [15] в проточном реакторе с использованием свеллографи-ческого мониторинга [16, 17]. После отщепления от смолы и одновременного деблокирования [15] продукты хроматографировали на сефадексе G-10. По данным аминокислотного анализа и об-ращенно-фазовой хроматографии, содержание целевых пептидов в образцах составляло 80 - 98%. Все пептиды содержали ацетамидометильную группу на остатках Cys. Такой выбор связан с противоречивостью данных о роли дисульфид-ной связи между остатками Cys 192 и Cys 193 в связывании нейротоксинов [3, 8-9, 18] и с тем, что при использовании соответствующих пептидов со свободными SH-группами состояние их окисления не контролировалось.
ФРАГМЕНТЫ 183 - 198 И 125 - 145 а-СУБЪЕДИНИЦЫ
Для связывания использованы моно[1251]йоди-рованные производные а-бунгаротоксина и нейротоксина II, полученные хлораминовым методом. Иодирование а-бунгаротоксина проводили в модифицированных условиях работы [19], используя двукратный молярный избыток К[1251] и хлорамина Т и увеличив время реакции до 5 мин. Ней-ротоксин II йодировали в условиях работы [14] с последующей очисткой производных методом ионообменной ВЭЖХ (колонка НЕМА BIO 1000СМ, Tessek Ltd., Чехия). Следует отметить, что при разделении производных, полученных в результате йодирования препаратов а-бунгаро-токсина, приобретенных у различных фирм (Serva и Sigma), мы обнаружили существенные различия в хроматографических профилях. Хроматография немодифицированных токсинов (рис. 1) показала, что а-бунгаротоксин фирмы Sigma содержит два компонента почти в равных количествах, а в а-бунгаротоксине фирмы Serva один из компонентов является преобладающим (наличие нескольких полипептидных компонентов в коммерческих препаратах токсина наблюдалось нами ранее [20]). Анализ полученных фракций методом масс-спектроскопии показал, что выделенные нами две фракции различаются по массе на 28 единиц, что соответствует двум метиленовым группам. Полученная разница может быть объяснена наличием в препарате двух изоформ с заменой Ala—>-Val. Вариант а-бунгаротоксина, содержащий в положении 31 Val вместо Ala, был ранее отделен от препарата с помощью ионообменной хроматографии на Mono-S (Pharmacia) [21], при этом обе формы токсина с одинаковым сродством связывались с ацетилхолиновым рецептором. Учитывая эти данные, мы использовали для связывания с пептидами обе изоформы а-бунга-ротоксина.
Пептиды иммобилизовали на гибких титро-вальных планшетах (96-well P.E.T.G. assay plates фирмы Costar). Раствор пептида в 50% водном ацетонитриле вносили в лунку планшета (3 нмоль в лунку) и высушивали в термостате при 45°С. После этого, для блокирования неспецифических мест связывания инкубировали с 2% бычьим сывороточным альбумином и затем добавляли радиоактивный токсин. После 2 ч инкубации при комнатной температуре токсин удаляли, промывали лунки фосфатно-солевым буфером, разрезали планшет и определяли количество связанного радиоактивного токсина, используя у-счетчик Coinpugamma 1282 (LKB, Швеция). Для учета неспецифического связывания пептиды инкубировали с радиоактивными производными токсинов в присутствии избытка немодифицированных токсинов. На рис. 2 в качестве примера представлены кривые связывания а-бунгаротоксина и нейротоксина II с пептидом а 186 - 198. Аналогичные кривые получены и для двух других исследо-
153
^226
0.01 -
0 5 10 15 20 25 мин
Рис. 1. Ионообменная хроматография а-бунгаротоксина фирм Serva (У) и Sigma (2) на колонке НЕМА-ВЮ 1000 СМ (4 х 250 мм) в градиенте концентрации NaCl в 5 мМ натрий-фосфатном буфере (рН 7.4). Скорость элюции 0.5 мл/мин.
с, х 10"5, М
Рис. 2. Кривые связывания а-бунгаротоксина (/) и нейротоксина II (2) с пептидом а186 - 198. с,, с2- концентрации добавленного и связанного токсинов соответственно.
ванных пептидов. Параметры связывания (таблица) определены с помощью анализа полученных кривых по программе ЕпгйИег (ВюзоЙ).
Как видно из таблицы, оба токсина имеют довольно близкие константы диссоциации при взаимодействии с пептидами а186 - 198 и а183 - 198, в то же время эффективность взаимодействия с пептидом а125 - 145 для нейротоксина II примерно на порядок выше, чем для а-бунгаротоксина. Таким образом, вывод, сделанный в работе [3] на основании использования других коротких ней-ротоксинов (эрабутоксин Ь и кобротоксин), о том, что короткие нейротоксины связываются исключительно с фрагментом 122 - 138, не является справедливым для всей подгруппы коротких
154
КЛУКАС и др.
Связывание а-бунгаротоксина (БТ) и нейротоксина II (НТ) с фрагментами а-субъединицы ацетилхолиново-го рецептора (приведена Kd, мкМ)
Пептид ET HT
GWKHWVYYTCCPDTPY (183 198) 1.8 ±0.8 2.7 ± 1.3
HWVYYTCCPDTPY (186 - 198) 1.3 ± 0.6 0.5 ± 0.4
KS YCEIIVTH FPFDQQNCTM К (125- 145) 60.3 ±6.1 4.9 ± 1.2
нейротоксинов. Возможно, так же как и при взаимодействии с интактным мембранным рецептором, эффективность взаимодействия с фрагментами а-субъединицы зависит не только от принадлежности токсина к той или иной подгруппе, но и от индивидуальных свойств данного нейротоксина.
Следует отметить, что наличие ацетамидоме-тильной группы на остатках Cys не приводит к потере токсинсвязывающей активности в исследованных пептидах и, следовательно, дисульфид-ная связь в пептидах не является абсолютно необходимой для связывания.
Таким образом, полученные нами данные указывают на наличие различных участков связывания нейротоксинов на а-субъединице ацетилхо-линового рецептора и подтверждают принятую в настоящее время модель многоточечного взаимодействия токсинов с рецептором.
Данная работа* - часть Международного проекта, выполняемого совместно с Институтом биохимии Свободного университета Берлина при поддержке Министерства науки, высшей школы и технической политики Российской Федерации и Федерального министерства научных исследований и технологий (BMFT) Германии. Авторы выражают благодарность П. Франке (Свободный университет Берлина) за съемку масс-спектров.
* Когда статья находилась в печати, появилась работа [22], в которой исследовано взаимодействие различных нейротоксинов с пептидами из двух вышеуказанных областей а-субъединицы. Наши результаты для нейротоксина II согласуются с результатами, полученными в [22] для гомологичного короткого а-нейротоксина Naja nigricollis.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Gershoni J.M., Hawrot Е., Lenz T.L. // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1983. V. 80. № 16. P. 4973 - 4977.
2. Mulac-Jericevic В., Atassi M.Z. // Biochem. J. 1987. V. 248. № 2. P. 847 - 852.
3. Ruan K.-H., Bradly G.S., Atassi M.Z. // Biochem. J.
1991. V. 274. №2. P. 849 - 854.
4. Conti-Tronconi B.M., Tang F., Diethelm B.M., Spenor S.R., Maeiicke S., Maelicke A. // Biochemistry. 1990. V. 29. № 26. P. 6221 - 6230.
5. Wahlsten I.L., Lindstrum J.M., Conti-Tronconi B.M. // J. Ree. Res. 1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.