МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 76, № 6, с. 902-907
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 601.2:602.3
ФРАКЦИИ ЯЧМЕННОЙ БАРДЫ КАК РОСТОВЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ ПРОБИОТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ
© 2007 г. Г. И. Новик*1, И. Ваужинчик**, О. Норлоу**, Э. Швайцер-Дей**
*Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь **Лундский университет, Отдел фундаментальной и прикладной биохимии, Лунд, Швеция
Поступила в редакцию 19.03.2006 г.
Изучена пригодность белковой и полисахаридной фракций пивной ячменной дробины в качестве основы ростовых и ферментационных сред для пробиотических бактерий. Оптимальными питательными средами для культивирования бактерий являлись варианты на основе фракций дробины, в состав которых введены дополнительно лактоза, аскорбиновая кислота, дрожжевой экстракт и минеральные соли. Рост бактерий характеризовался высоким выходом биомассы и содержанием жизнеспособных клеток, интенсивной продукцией органических кислот. Морфологически клетки молочнокислых и бифидобактерий были представлены характерными палочковидными формами.
Ключевые слова: бифидобактерии, молочнокислые бактерии, фракции пивной ячменной дробины, рост, кислотообразование, пробиотики.
В настоящее время наблюдается растущий интерес к пробиотикам и пребиотикам. Молочнокислые и бифидобактерии хорошо известны как пробиоти-ческие микроорганизмы, обладающие рядом интересных функциональных и технологических характеристик [1-4]. При разработке новых технологий получения пробиотиков требуются не только штаммы с высокой активностью, но и дешевые среды для их культивирования. Компоненты сред, являясь источником угле рода, азота и фосфора для роста бактерий, могут также оказывать благотворное действие на здоровье человека. Известно, что продукты переработки зерна могут использоваться в качестве эффективных субстратов для культивирования молочнокислых и бифидобактерий, обеспечивая их высокий ростовой потенциал, продукцию метаболитов и стабильность штаммов при хранении [5-8]. Продукты переработки зерна могут действовать как пребиотики, селективно стимулируя рост молочнокислых и бифидобактерий, присутствующих в кишечнике. Зерна злаков в своем составе содержат водорастворимые углеводные полимеры - бета-глюкан и арабиноксилан, олигосаха-риды - галакто- и фруктоолигосахариды, а также нерастворимые в воде полисахариды - ксилан, целлюлозу и крахмал - вещества, предположительно, выполняющие функцию пребиотиков. Кроме того, эти пищевые волокна могут включаться в пищевой рацион как источник углеводов, вызывающих множественные положительные физиологические эффекты [5]. В этой связи недавно на рынок на-
* Адресат для корреспонденции (e-mail: collection@mbio.bas-
net.by).
чали поставлять пробиотические пищевые продукты, содержащие микроорганизмы видов Lactobacillus и Bifidobacterium и продукты переработки зерна, выступающие в качестве пребиотического компонента. Продукты на основе проросшего ячменя и их полисахаридная фракция эффективно предотвращают диарею, обеспечивают противоэнтерический эффект и могут быть использованы для профилактики колитов [6].
Пивная ячменная дробина, содержащая белковую и полисахаридную фракции, относится к отходам пивоварения; ее получают после затирания солода и отъема сусла [9, 10]. Интерес к использованию ее белковой и полисахаридной фракций растет, поскольку они могут использоваться как функциональная диетическая добавка для лечения кишечных расстройств либо как альтернативный источник белка и углеводов в рационе животных [11, 12]. Ранее нами было показано, что белковая фракция пивной ячменной дробины может быть рекомендована как основа питательной среды для выделения и поддержания актинобактерий, продукции ими биологически активных веществ и интенсивного спорообразования [13].
Целью настоящей работы явилось исследование физиолого-биохимических и морфологических особенностей молочнокислых и бифидобактерий при росте на питательных средах на основе белковой и полисахаридной фракций пивной ячменной дробины.
Таблица 1. Состав сред
Обозначения сред Основной компонент ростовой среды Добавки, в %
BHB Бульон с сердечно-мозговым экстрактом Лактоза - 0.8, аскорбиновая кислота - 0.05, ацетат аммония - 0.3, ацетат натрия - 0.2, тринатрий цитрат - 0.3, MgSO4 ■ 7Н20 - 0.012, MnSO4 - 0.005
PF-1 Белковая фракция ячменной дробины Без добавок
PF-2 То же Лактоза - 1
PF-3 То же Лактоза - 1, аскорбиновая кислота - 0.05
PF-4 То же Лактоза - 1, аскорбиновая кислота - 0.05, дрожжевой экстракт - 0.5
PF-5 То же Лактоза - 1, аскорбиновая кислота - 0.05, дрожжевой экстракт - 0.5, ацетат аммония - 0.3, ацетат натрия - 0.2, тринатрий цитрат - 0.3, MgSO4 ■ 7Н20 - 0.012 и MnSO4 - 0.005
FF-1 Полисахаридная фракция ячменной дробины Без добавок
FF-2 То же Лактоза - 1
FF-3 То же Лактоза - 1, аскорбиновая кислота - 0.05
FF-4 То же Лактоза - 1, аскорбиновая кислота - 0.05, дрожжевой экстракт - 0.5
FF-5 То же Лактоза - 1, аскорбиновая кислота - 0.05, дрожжевой экстракт - 0.5, ацетат аммония - 0.3, ацетат натрия - 0.2, тринатрий цитрат - 0.3, MgSO4 ■ 7Н20 - 0.012 и MnSO4 - 0.005
Примечание. рН каждой среды доводили до 7.2, после чего среды стерилизовали при 121°C в течение 15 мин; BHB - бульон с сердечно-мозговым экстрактом (Brain Heart Broth, "Merck", Германия); фракции пивной ячменной дробины PF-1, FF-1 получали согласно методике [13]; содержание агара в полужидких средах BHB, PF-5 и FF-5 - 0.2%.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы бактерий. Штамм Bifidobacterium ado-lescentis 94 БИМ, использованный в данном исследовании, получен из Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов (Институт микробиологии Национальной Академии наук Беларуси). Культура молочнокислых бактерий Lactobacillus sp. выделена из коммерческой субстанции Lactobacteri-num siccum ("Иммунопрепарат", Россия).
Состав и приготовление сред. Фракционирование дробины осуществлялось просеиванием через сито BoMill AB (Швеция) [10, 13]. Сепарировали две фракции: грубую полисахаридную (сито, 8 меш) и тонкую белковую (сито, 50 меш). Для приготовления сред 2 г соответствующей фракции вносили в 100 мл дистиллированной воды, перемешивали и автоклавировали полученную суспензию при 121°C в течение 15 мин, затем охлаждали и фильтровали через бумажный фильтр; pH фильтрата доводили до 7.2 с использованием 0.5 M NaOH. Состав сред, приготовленных на основе фракций и использованных для изучения активности роста, продукции уксусной кислоты и морфологии клеток бифидобак-терий и молочнокислых бактерий, приведен в табл. 1.
Культивирование бактерий. 4.5 мл суспензии, содержащей 109/мл клеток, засевали в 90 мл среды в колбы емкостью 100 мл. Бактерии культивировали
в термостате при 37°С в течение 24-48 ч в статических условиях. Количество жизнеспособных клеток определяли в 1 мл бактериальной культуры (число КОЕ/мл) методом предельных разведений с последующим высевом на полужидкую (содержание агара 0.2%) селективную тиогликолевую среду [14]. Для характеристики колониального роста молочнокислых и бифидобактерий проводили высев десятикратных разведений (10-6-10-8) на полужидкие среды на основе белковой и полисахаридной фракций пивной ячменной дробины.
Накопление биомассы определяли по оптической плотности клеточной суспензии при длине волны 590 нм; активную кислотность среды (рН) как описано ранее [14].
Продукция кислот. Содержание ацетата измеряли с использованием метода газовой хроматографии на колонке ИР-РРАР при 80-140°С, температуре инжектора 180°С и пламенно-ионизационного детектора 260°С. Азот применялся как газ-носитель при скорости потока 67 мл/мин. Профильтрованную пробу (0.9 мл) смешивали с 0.1 мл 10% фосфорной кислоты и 1 мкл этой смеси вводили в импульсном режиме. Для характеристики ацидогенеза бифидобактерий концентрацию молочной кислоты рассчитывали по Лауэру [15].
Изучение морфологии клеток. Методики, описанные в работе [3], применяли для изучения морфологии клеток пробиотических бактерий. Мор-
Таблица 2. Рост и ацидогенез бифидобактерий на средах, содержащих фракции пивной ячменной дробины
Жизнеспособность клеток, КОЕ/мл
OD, 590 нм
Среда 24 ч 48 ч 24 ч 48 ч 24 ч 48 ч 24 ч 48 ч
ВНВ 5 х 109 5 х 109 0.79 0.79 1.20 1.20 4.55 4.55
PF-1 2 х 108 4 х 108 0.24 0.28 0.37 0.42 4.75 4.71
PF-2 1 х 109 2 х 109 0.38 0.40 0.57 0.6 4.02 4.03
PF-3 1 х 109 3 х 109 0.37 0.41 0.56 0.62 4.05 4.01
PF-4 3 х 109 4 х 109 0.53 0.56 0.81 0.85 4.01 4.00
PF-5 6 х 109 5 х 109 0.82 0.85 1.24 1.29 4.55 4.56
FF-1 8 х 107 9 х 107 0.12 0.13 0.18 0.20 4.52 4.43
FF-2 5 х 108 8 х 108 0.25 0.26 0.37 0.39 4.01 4.01
FF-3 5 х 108 9 х 108 0.25 0.30 0.37 0.46 4.02 4.01
FF-4 1 х 109 2 х 109 0.44 0.49 0.66 0.74 4.01 4.01
FF-5 2 х 109 3 х 109 0.73 0.73 1.10 1.10 4.02 4.01
Биомасса, мг/мл
рН
Уксусная Молочная
кислота, кислота,
мг/л мг/л
24 ч 24 ч
11580 7720
820 547
1360 907
2470 1647
3215 2143
5180 3453
1415 943
2890 1927
3090 2060
3690 2460
5080 3387
Примечание. Расшифровка сокращений приведена в табл. 1. Для сред, содержащих соли уксусной кислоты (табл. 1), для коррекции значений концентраций ацетата в среде культивирования производили вычитание соответствующих исходных значений. Уровень продукции уксусной и молочной кислоты измеряли через 24 ч.
фологию бактериальных клеток анализировали с помощью микроскопа LABORHOT-2, "Мтоп" (Япония) при 1000-кратном увеличении.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Составы различных приготовленных ростовых сред с бульоном BHB [16], белковой и полисахарид-ной фракциями пивной ячменной дробины приведены в табл. 1. Среды BHB, использовавшиеся в данной работе, - это стандартные органические среды, сравнимые по своим характеристикам с ростовыми средами на основе обезжиренного молока, традиционно рекомендуемыми для культивирования бифидобактерий и молочнокислых бактерий. За исключением сред, маркированных как PF1 и FF1, остальные среды модифицировали различными добавками. Показатели, характеризующие рост культур - жизнеспособность клеток, урожай биомассы, продукцию органических кислот, изменение рН культуральной жидкости в процессе ферментации - приведены в табл. 2, 3. Установлено, что питательные среды на осно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.